ケーススタディ9：プローブ依存性結合は、1-アミノベンゾトリアゾール（ABT）によるCYP2C9の不活性化の欠如を説明しています

主要なシトクロムP450（CYP）アイソフォームを阻害する新しい化学物質が阻害する可能性は、薬物薬物相互作用責任を伴う薬物を発症するリスクを最小限に抑えるために日常的に評価されます。CYP阻害アッセイは、高スループット形式で日常的に実行され、多数の化合物を効率的にスクリーニングします。ジクロフェナクをCYP2C9プローブ基質として使用した時間節約アッセイを評価する際に、ディクロフェナクを使用して最小限の阻害が検出されたが、（S）ワルファリンを使用して強力な阻害をもたらし、比較的拘束力のある部位の存在を支持する強力な阻害をもたらす矛盾が観察されました。大規模なCYP2C9活性部位空洞。これらの観察により、PAN-CYP不活性化剤1-アミノベンゾトリアゾール（ABT）のCYP2C9の報告された非効果的な不活性化を説明することに関するさらなる洞察が提供されました。機械的可逆的および時間依存性阻害実験により、ABTによる効果のないCYP2C9の不活性化もプローブ依存性であり、プローブ基質としてのワルファリンを使用して、Diclofenacと比較してより強力なCYP2C9阻害をもたらすことが明らかになりました。ABTとジクロフェナク間の可逆的および時間依存性阻害実験に（S） - ワルファリンを添加すると、CYP2C9を介したジクロフェナク代謝に対するABTの阻害効果の減衰が生じました。分子ドッキングの研究により、（S） - ワルファリンとジクロフェナクがCYP2C9活性部位の異なる領域で優先的に結合し、（S） - ワルファリンが遠位の「ワルファリン結合ポケット」を占有し、ジクロフェナックが活性ヘムの近くの粉砕部位を占有していることがさらに確認されました。部分。ABTは、遠位ワルファリン結合ポケットに優先的に結合し、ジクロフェナクがABTの存在下でCYP2C9活性部位へのアクセスから最小限に抑制されることを支持しているため、最小限の不活性化が生じます。同時に、（S）-WarfarinとABTのドッキングは、遠位結合部位の（S） - ワルファリンの伴奏ABTがABTであることを明らかにし、CYP2C9活性部位へのABTの結合をもたらし、CYP2C9の強力な不活性化の観察を支持します。ワルファリンはプローブ基板です。これらの結果は、CYP阻害の可能性を評価するときにプローブ選択が重要であることを強調しており、CYP3A4に日常的に使用されるアプローチと同様に、CYP2C9に複数のプローブを使用することをお勧めします。さらに、in vitroおよびin vivoの両方で、治療化合物のCYP活性のPAN阻害剤としてのABTの利用は、CYP2C9基質について残留CYPを介した酸化代謝が潜在的に観察される可能性があり、必ずしも発生するべきではないという理解を伴う必要があります。非P450を介した代謝へ。

The potential for new chemical entities to inhibit the major cytochrome P450 (CYP) isoforms is routinely evaluated to minimize the risk of developing drugs with drug-drug interaction liabilities. CYP inhibition assays are routinely performed in a high-throughput format to efficiently screen large numbers of compounds. In evaluating a time-saving assay using diclofenac as the CYP2C9 probe substrate, a discrepancy was observed in which minimal inhibition was detected using diclofenac whereas using (S)-warfarin resulted in potent inhibition, supporting the presence of dual-binding sites in the relatively large CYP2C9 active site cavity.These observations provided further insights into explaining the reported ineffective inactivation of CYP2C9 for the pan-CYP inactivator 1-aminobenzotriazole (ABT). Mechanistic reversible and time-dependent inhibition experiments revealed that the ineffective CYP2C9 inactivation by ABT was also probe-dependent, with utilization of (S)-warfarin as the probe substrate resulting in more potent CYP2C9 inhibition by ABT compared to diclofenac. Addition of (S)-warfarin to the reversible and time-dependent inhibition experiments between ABT and diclofenac resulted in an attenuation of the inhibitory effects of ABT on CYP2C9-mediated diclofenac metabolism. Molecular docking studies further confirmed that (S)-warfarin and diclofenac preferentially bind in different regions of the CYP2C9 active site, with (S)-warfarin occupying a distal "warfarin-binding pocket" and diclofenac occupying a binding site close to the active heme moiety. ABT preferentially binds in the distal warfarin-binding pocket, supporting that diclofenac is minimally deterred from access to the CYP2C9 active site in the presence of ABT, thus resulting in minimal inactivation. Simultaneously docking of (S)-warfarin and ABT revealed that (S)-warfarin outcompetes ABT for the distal binding site and results in the binding of ABT to the CYP2C9 active site, supporting the observations of potent inactivation of CYP2C9 when (S)-warfarin is the probe substrate.These results highlight that probe selection is crucial when evaluating CYP inhibition potential, and it is recommended that multiple probes be utilized for CYP2C9, similar to the approach routinely employed for CYP3A4. Further, utilization of ABT as a pan-inhibitor of CYP activity for investigational compounds, both in vitro and in vivo, should be accompanied with the understanding that residual CYP-mediated oxidative metabolism could potentially be observed for CYP2C9 substrates and should not necessarily be attributed to non-P450-mediated metabolism.