REPハイブリッドを使用したアデノ関連ウイルスベクターのゲノムパッケージング効率の改善

組換えアデノ関連ウイルス（RAAV）は、さまざまな遺伝子治療アプリケーションで最も一般的に使用されるベクターの1つです。過去20年間で、研究は主に新しいキャップの特性評価と分離に焦点を当てており、遺伝子は何百もの自然で操作されたAAV CapSIDバリアントをもたらしましたが、他の主要なAAVオープンリーディングフレームであるREP遺伝子はあまり研究されていません。これは、AAV血清型2（AAV2）のREP遺伝子が、組換えゲノムの一本鎖DNAパッケージをほとんどのAAV血清型および操作したカプシドに可能にするという事実によるものです。ただし、すべてのベクタープロダクションの主要な副産物は空のAAVカプシドであり、特に非AAV2ベクターの場合、カプシ化されたベクターゲノムがありません。パッケージングプロセスはRAAV生産のレート制限ステップと見なされているにもかかわらず、他のAAV血清型からのREP遺伝子のいずれも、パッケージング効率について特徴付けられていません。したがって、この研究では、AAV2 repは、選択数のAAV血清型のrep遺伝子に置き換えられました。ただし、これにより、標準のAAV2-REPシステムと比較して、CapSIDタンパク質発現が低下しました。さらなる実験では、AAV2 REP遺伝子の3 '末端を再導入してカプシド発現の増加を促進し、異なるAAV REPタンパク質間の一連のキメラが生成され、ベクターゲノム包装能力のために特徴付けられました。これらの新規REPハイブリッドの利用により、テストされた非AAV2血清型のすべてで約2〜-4倍のゲノムを含む（フル）カプシドの割合が増加しました。したがって、これらの担当者はRaav生産に革命をもたらす可能性があります。重要性すべてのアデノ関連ウイルス（AAV）ベクター生産システムの主要な副産物は、「空の」カプシドであり、望ましい治療遺伝子を失い、したがって、標的疾患の治療に治療的利益を提供しません。実際、空のカプシドは、追加の精製手順によって除去されないと、in vivo遺伝子療法で追加の免疫応答を誘発する可能性があります。したがって、ゲノムパッケージングの効率を高め、AAV生物学からの空のカプシドの数を減らす必要があります。この研究で説明されているさまざまなAAV血清型からの新しい担当者のハイブリッドは、テストされたすべてのAAV血清型の空のキャプシドの割合を減らし、ゲノム含有AAVカプシドの全体的な収量を同時に改善することができます。生成されたAAV遺伝子治療製品の生産を最適化するために、既存のAAV製造プロトコルに簡単に統合することができます。

Recombinant adeno-associated viruses (rAAVs) are one of the most commonly used vectors for a variety of gene therapy applications. In the last 2 decades, research focused primarily on the characterization and isolation of new cap, genes resulting in hundreds of natural and engineered AAV capsid variants, while the rep gene, the other major AAV open reading frame, has been less studied. This is due to the fact that the rep gene from AAV serotype 2 (AAV2) enables the single-stranded DNA packaging of recombinant genomes into most AAV serotype and engineered capsids. However, a major by-product of all vector productions is empty AAV capsids, lacking the encapsidated vector genome, especially for non-AAV2 vectors. Despite the packaging process being considered the rate-limiting step for rAAV production, none of the rep genes from the other AAV serotypes have been characterized for their packaging efficiency. Thus, in this study AAV2 rep was replaced with the rep gene of a select number of AAV serotypes. However, this led to a lowering of capsid protein expression, relative to the standard AAV2-rep system. In further experiments the 3' end of the AAV2 rep gene was reintroduced to promote increased capsid expression and a series of chimeras between the different AAV Rep proteins were generated and characterized for their vector genome packaging ability. The utilization of these novel Rep hybrids increased the percentage of genome containing (full) capsids approximately 2- to -4-fold for all of the non-AAV2 serotypes tested. Thus, these Rep chimeras could revolutionize rAAV production. IMPORTANCE A major by-product of all adeno-associated virus (AAV) vector production systems are "empty" capsids, void of the desired therapeutic gene, and thus do not provide any curative benefit for the treatment of the targeted disease. In fact, empty capsids can potentially elicit additional immune responses in vivo gene therapies if not removed by additional purification steps. Thus, there is a need to increase the genome packaging efficiency and reduce the number of empty capsids from AAV biologics. The novel Rep hybrids from different AAV serotypes described in this study are capable of reducing the percentage of empty capsids in all tested AAV serotypes and improve overall yields of genome-containing AAV capsids at the same time. They can likely be integrated easily into existing AAV manufacturing protocols to optimize the production of the generated AAV gene therapy products.