NLRファミリーのターゲットシーケンスを使用して、クロナルティウムリビコラに対する樹木松の耐性の細かい分離

背景：ヌクレオチド結合部位（NBS）およびロイシンリッチリピート（LRR）ドメイン（NLR）を備えたタンパク質は、さまざまな病原体や害虫からの攻撃に抵抗するための最も重要な耐性（R）ファミリーの1つを構成しています。リンバーパイン（Pinus flexilis）の利用可能なトランスクリプトームは、世界中の5つのニードルパインの白い松の葉錆（WPBR）の因果真菌病原体であるCronartium ribicolaに対する宿主耐性において、NLR遺伝子と関連する耐性遺伝子類似体（RGA）を特徴付けることができます。以前は、Pinus Consensus Linkage Group 8（LG-8）でC. ribicolaに対する完全な抵抗性を付与する繊維松の主要遺伝子遺伝子座（CR4）をマッピングしました。しかし、NLR遺伝子の遺伝的分布と耐性対立性対立遺伝子との相違はまだ不明です。 結果：CR4遺伝子座でNLR遺伝子を識別するために、本研究では、CR4分離種子ファミリーのターゲットシーケンスを使用して合計480 RGAを再配置しました。単一のヌクレオチド多型（SNP）と遺伝子マッピングの呼び出しに続いて、155個の遺伝子から合計541個のSNPが12個のLGにマッピングされました。CR4領域では、CR4領域と共分離したものを含む3つの推定NLR遺伝子がCR4領域で新しくマッピングされました。CR4対照表現型とのNLRの緊密な結合は、有意性テストのために極端な表現型ゲノムワイド関連研究（XP-GWAS）を使用して、バルク分離分析（BSA）によってさらに確認されました。CR4領域における局所タンデムの重複は、砂糖松のゲノム配列を使用したシンテン分析によってさらにサポートされました。NLRファミリーでは、有意な遺伝子発散が観察されており、局所的な重複遺伝子では、多様な選択圧力が比較的高いことを明らかにしています。ほとんどの遺伝子は低レベルで同様の発現パターンを示しましたが、一部は耐病性に関連する遺伝的背景の影響を受けました。微細な遺伝的解剖、進化分析、および発現プロファイリングからの証拠は、2つのNLR遺伝子がWPBRに対するCR4の最も有望な候補であることを示唆しています。 結論：この研究は、CR4遺伝子座の遺伝的アーキテクチャに関する根本的な洞察と、材料育種におけるマーカー支援選択のためのNLRバリアントのセットを提供します。CR4遺伝子座で新規NLR遺伝子が同定され、CR4候補は、このR遺伝子の展開を、材料松の繁殖プログラムの他の主要/マイナー遺伝子と組み合わせて展開します。

BACKGROUND: Proteins with nucleotide binding site (NBS) and leucine-rich repeat (LRR) domains (NLR) make up one of most important resistance (R) families for plants to resist attacks from various pathogens and pests. The available transcriptomes of limber pine (Pinus flexilis) allow us to characterize NLR genes and related resistance gene analogs (RGAs) in host resistance against Cronartium ribicola, the causal fungal pathogen of white pine blister rust (WPBR) on five-needle pines throughout the world. We previously mapped a limber pine major gene locus (Cr4) that confers complete resistance to C. ribicola on the Pinus consensus linkage group 8 (LG-8). However, genetic distribution of NLR genes as well as their divergence between resistant and susceptible alleles are still unknown. RESULTS: To identify NLR genes at the Cr4 locus, the present study re-sequenced a total of 480 RGAs using targeted sequencing in a Cr4-segregated seed family. Following a call of single nucleotide polymorphisms (SNPs) and genetic mapping, a total of 541 SNPs from 155 genes were mapped across 12 LGs. Three putative NLR genes were newly mapped in the Cr4 region, including one that co-segregated with Cr4. The tight linkage of NLRs with Cr4-controlled phenotypes was further confirmed by bulked segregation analysis (BSA) using extreme-phenotype genome-wide association study (XP-GWAS) for significance test. Local tandem duplication in the Cr4 region was further supported by syntenic analysis using the sugar pine genome sequence. Significant gene divergences have been observed in the NLR family, revealing that diversifying selection pressures are relatively higher in local duplicated genes. Most genes showed similar expression patterns at low levels, but some were affected by genetic background related to disease resistance. Evidence from fine genetic dissection, evolutionary analysis, and expression profiling suggests that two NLR genes are the most promising candidates for Cr4 against WPBR. CONCLUSION: This study provides fundamental insights into genetic architecture of the Cr4 locus as well as a set of NLR variants for marker-assisted selection in limber pine breeding. Novel NLR genes were identified at the Cr4 locus and the Cr4 candidates will aid deployment of this R gene in combination with other major/minor genes in the limber pine breeding program.