単一鎖RNAプローブを使用した動物組織における犬ジステンパーウイルスの陰性鎖および陽性鎖RNAの同定

このレポートでは、単一鎖RNAプローブを使用して、犬組織の犬のジステンパーウイルス（CDV）の陰性鎖（ゲノム）および陽性鎖（メッセンジャー）RNAを識別する手法について説明します。CDVのP遺伝子に対応するINSERT DNAを含むプラスミド（PSP64-PおよびPSP65-P）は、放射性同位体の存在下でSP6ポリメラーゼによって転写され、放射性標識単一鎖RNAプローブを生成しました。PSP65-Pから転写されたRNAは、PSP64-Pから生成された負の鎖（ゲノム）とRNAを相補的であり、CDVの陽性鎖（メッセージ）を相補的です。単一鎖RNAプローブの結合特異性は、北ブロットで決定されました。ハイブリダイゼーションアッセイでこれらのRNAプローブを使用すると、ニック翻訳反応によって標識された二重鎖DNAプローブ（全体のプラスミドまたは精製インサートDNA）から得られたものよりも高感度と特異性が生じました。また、相補性RNAの逆転写標識による単一鎖DNAプローブの作成についても説明します。相補性RNAは、クローンDNA（PSP64-PおよびPSP65P）の転写によって産生されました。単一鎖RNAプローブと単一鎖DNAプローブは、感度が類似していました。単一鎖RNAおよびDNAプローブは、CDV-A75/17に感染した犬のエタノラ酢酸固定組織切片に適用されました。組織ハイブリダイゼーションで32p標識プローブを使用し、35S標識プローブをin situハイブリダイゼーションで使用して、陰性および陽性の鎖RNAを特定しました。このレポートでは、このウイルスホストシステムでウイルス発現を研究するために、単一鎖RNAおよびDNAプローブを組織ハイブリダイゼーションとその場ハイブリダイゼーションアッセイでうまく使用できることを実証します。

In this report, we describe a technique for identifying negative strand (genome) and positive strand (messenger) RNA of canine distemper virus (CDV) in dog tissues by using single stranded RNA probes. Plasmids (pSP64-P and pSP65-P) which contain insert DNA corresponding to the P gene of CDV were transcribed by SP6 polymerase in the presence of radioisotope to produce radiolabeled single stranded RNA probes. RNA transcribed from pSP65-P is complementary to the negative strand (genome) and RNA produced from pSP64-P is complementary to the positive strand (message) of CDV. The binding specificity of the single stranded RNA probes was determined on Northern-blots. The use of these RNA probes in hybridization assays resulted in greater sensitivity and specificity than that obtained from double stranded DNA probes (either whole plasmids or purified insert DNA) which were labeled by the nick translation reaction. We also describe the making of single stranded DNA probes by reverse transcription labeling of complementary RNA. The complementary RNA was produced by the transcription of cloned DNA (pSP64-P and pSP65P). Single stranded RNA probes and single stranded DNA probes were similar in sensitivity. The single stranded RNA and DNA probes were applied to ethanolacetic acid fixed tissue sections from dogs infected with CDV-A75/17. We used 32P-labeled probes in tissue hybridizations and 35S-labeled probes in in situ hybridizations to identify negative and positive stranded CDV RNA. In this report we demonstrate that single stranded RNA and DNA probes can be used successfully in tissue hybridization and in situ hybridization assays to study viral expression in this virus-host system.