エンジニアリングダーピンアフィニティマトリックスを使用したMBP融合タンパク質の精製

マルトース結合タンパク質（MBP）には、融合タンパク質の溶解度を高める能力を備えた発現タグとしての長い歴史があります。十分な量のMBP融合タンパク質を取得するための重要なステップは精製です。MBP融合タンパク質の親和性精製のための市販のアミロースマトリックスには、2つの主な問題があります。（i）低い（マイクロモル）親和性と（ii）粗細胞に存在するアミラーゼによる多糖類の切断による限られた数の用途抽出する。ここでは、タンパク質間相互作用に基づいた新しい親和性浄化アプローチを提示します。固定化された設計されたアンキリンリピートタンパク質Off7（Darpin off7）を含むアフィニティマトリックスを開発しました - 以前はナノモル親和性を持つMBPバインダーを特定しました。Darpin Affinity Matrixの機能は、MBPタグ付きの緑色蛍光タンパク質とフラボドキシンの精製でテストされました。MBP-Darpin Off7相互作用に基づいたMBP融合タンパク質の親和性精製により、単純な2段階の手順で融合タンパク質の精製が可能になります。ダーピンアフィニティマトリックス - 構築しやすく、アミラーゼに耐性があり、マルトース汚染に敏感で、複数の精製サイクルに再利用可能である - は、MBPタグを含むタンパク質の精製のために市販の親和性マトリックスに代替アプローチを提供します。

Maltose binding protein (MBP) has a long history as an expression tag with the ability to increase the solubility of fused proteins. A critical step for obtaining a sufficient amount of the MBP fusion protein is purification. Commercially available amylose matrix for the affinity purification of MBP fusion proteins has two main issues: (i) low (micromolar) affinity and (ii) the limited number of uses due to the cleavage of polysaccharide matrix by the amylases, present in the crude cell extract. Here, we present a new affinity purification approach based on the protein-protein interaction. We developed the affinity matrix which contains immobilized Designed Ankyrin Repeat Protein off7 (DARPin off7) - previously identified MBP binder with nanomolar affinity. The functionality of the DARPin affinity matrix was tested on the purification of MBP-tagged green fluorescent protein and flavodoxin. The affinity purification of the MBP fusion proteins, based on the MBP-DARPin off7 interaction, enables the purification of the fusion proteins in a simple two-steps procedure. The DARPin affinity matrix - easy to construct, resistant to amylase, insensitive to maltose contamination, and reusable for multiple purification cycles - provides an alternative approach to commercially available affinity matrices for purification of proteins containing the MBP tag.