標的療法に対する感受性は、PIK3CAのキナーゼとヘリカルドメイン変異を抱えるHER2増幅乳がん細胞間で異なります

背景：HER2増幅乳がんは、臨床的に定義された乳がんのサブタイプであり、そのためには複数の実行可能な標的療法があります。これらの標的療法に対する耐性は一般的な問題ですが、耐性が発生するメカニズムは不完全に定義されたままです。提案されているメカニズムの1つは、Pi3-キナーゼ経路の遺伝子の突然変異を介したものです。HER2経路からの細胞内シグナル伝達は、Pi3-キナーゼを介して発生する可能性があり、コード遺伝子PIK3CAの変異は発癌性であることが知られています。PIK3CAの変異は、HER2増幅サブタイプ内の症例の約20％のHER2増幅を伴う共生と共存します。 方法：アデノ関連ウイルスを介した遺伝子標的化を使用して、HER2増幅乳癌細胞における各PIK3CAホットスポット変異の同質性ノッキン変異体を生成しました。同一性クローンは、組み合わせ薬物スクリーニングを使用して分析され、HER2標的療法に対する微分応答を決定しました。ウエスタンブロット分析と免疫蛍光は、HER2標的療法に耐性のある細胞の独自の細胞内シグナル伝達ダイナミクスを明らかにしました。その後の組み合わせ薬物スクリーニングを使用して、HER2標的療法に対するニューレグリン-1を介した耐性を調査しました。最後に、in vitro実験の結果は、公開されているデータセットに推定されました。 結果：HER2標的療法での治療により、キナーゼドメイン（H1047R）の変異は、ヘリカルドメイン（E545K）ではなく、ラパチニブに対する耐性を高めることが明らかになりました。PI3-キナーゼPIP3の細胞内産物の染色によって示されるように、維持されたAktシグナル伝達は、キナーゼドメイン変異を伴う細胞のラパチニブ耐性を駆動します。この耐性は、下流のキナーゼAktに対する阻害剤との共抗力によって克服できます。さらに、PIP3ホスファターゼ、PTEN、フェノコピーのノックアウトこの結果。また、彼女の家族受容体のリガンドであるノイレグリン-1は、ホットスポット変異のいずれかを抱く細胞に対する耐性を付与し、組み合わせ療法に対する反応を調節することを示しています。最後に、TCGAおよびメタブリックデータコホートの分析を通じて、ホットスポット変異が治療耐性に関連する明確な発現プロファイルを持っているという臨床的証拠を示します。 結論：我々の結果は、細胞が存在するPIK3CAの変異に応じて、独自の細胞内シグナル伝達の違いを示しています。キナーゼドメインの変異のみがPi3-キナーゼシグナル伝達経路を完全に活性化し、HER2阻害の存在下で下流のシグナル伝達を維持します。さらに、標的療法で治療されたHER2増幅乳がん患者におけるPIK3CA変異状態とニューレグリン-1発現のレベルの両方を理解する上で潜在的に臨床的に重要であることを示し、これらの問題はさらに臨床的および臨床検査を必要とすることを示しています。

BACKGROUND: HER2-amplified breast cancer is a clinically defined subtype of breast cancer for which there are multiple viable targeted therapies. Resistance to these targeted therapies is a common problem, but the mechanisms by which resistance occurs remain incompletely defined. One mechanism that has been proposed is through mutation of genes in the PI3-kinase pathway. Intracellular signaling from the HER2 pathway can occur through PI3-kinase, and mutations of the encoding gene PIK3CA are known to be oncogenic. Mutations in PIK3CA co-occur with HER2-amplification in ~ 20% of cases within the HER2-amplified subtype. METHODS: We generated isogenic knockin mutants of each PIK3CA hotspot mutation in HER2-amplified breast cancer cells using adeno-associated virus-mediated gene targeting. Isogenic clones were analyzed using a combinatorial drug screen to determine differential responses to HER2-targeted therapy. Western blot analysis and immunofluorescence uncovered unique intracellular signaling dynamics in cells resistant to HER2-targeted therapy. Subsequent combinatorial drug screens were used to explore neuregulin-1-mediated resistance to HER2-targeted therapy. Finally, results from in vitro experiments were extrapolated to publicly available datasets. RESULTS: Treatment with HER2-targeted therapy reveals that mutations in the kinase domain (H1047R) but not the helical domain (E545K) increase resistance to lapatinib. Mechanistically, sustained AKT signaling drives lapatinib resistance in cells with the kinase domain mutation, as demonstrated by staining for the intracellular product of PI3-kinase, PIP3. This resistance can be overcome by co-treatment with an inhibitor to the downstream kinase AKT. Additionally, knockout of the PIP3 phosphatase, PTEN, phenocopies this result. We also show that neuregulin-1, a ligand for HER-family receptors, confers resistance to cells harboring either hotspot mutation and modulates response to combinatorial therapy. Finally, we show clinical evidence that the hotspot mutations have distinct expression profiles related to therapeutic resistance through analysis of TCGA and METABRIC data cohorts. CONCLUSION: Our results demonstrate unique intracellular signaling differences depending on which mutation in PIK3CA the cell harbors. Only mutations in the kinase domain fully activate the PI3-kinase signaling pathway and maintain downstream signaling in the presence of HER2 inhibition. Moreover, we show there is potentially clinical importance in understanding both the PIK3CA mutational status and levels of neuregulin-1 expression in patients with HER2-amplified breast cancer treated with targeted therapy and that these problems warrant further pre-clinical and clinical testing.