オンライン濃縮液液クロマトグラフィータンデム質量分析によるヒマミルク中の微量レベルメラトニンのハイスループット定量

母乳中のメラトニンのレベルは、幼児の発達と概日リズムの構築と密接に関連している可能性があります。このトピックに関する大規模な人口調査は、早期発達と概日リズムに関連する疾患の予防と治療に関する洞察を提供します。しかし、それはよく研究されていません。微量レベルの内因性メラトニンとサンプル収集の困難は、進捗を制限する課題の1つです。内因性メラトニン濃度を決定するための高い特異性と感度を備えた高スループット分析法は非常に望ましい。このホワイトペーパーでは、新しく開発された新しく開発された容易に動作しやすく操作され、高スループットに敏感なオンライン濃縮液体クロマトグラフィータンデム質量分析（LC-MS/MS）メソッドが報告されます。メラトニン-D3（MEL-D3）をキャリブレーション曲線の代理標準として使用し、メラトニンD4（MEL-D4）を内部標準として使用しました。サンプル調製は、アセトニトリル（ACN）を使用したタンパク質沈殿により、96ウェルプレートで単純に実行されました。上清を、拡大したサンプルループとミキサーを備えた簡単に構成されたLC-MS/MSシステムに直接注入されました。陽性モードの複数反応モニタリング（MRM）は、牛乳中のメラトニンの測定に採用されました。100μLサンプルを分析に使用し、キャリブレーション曲線線形範囲は1〜1000 pg ML-1でした。3つの検証バッチでは、正確性は相対的な公称濃度から11.0％の偏差以内でしたが、アッセイ内およびアッセイ間精度はそれぞれ4.1％以下および6.8％以下の相対標準偏差（RSD）でした。検証実験ではマトリックス効果が観察されましたが、内部標準（MEL-D4）と標識された安定した同位体はそれを修正することができ、MEL-D3/MEL-D4の全体的な相対マトリックス効果は100％近くでした。メソッドの全体的なスパイク回復は、5.1％RSDで101.7％でした。現在報告されている方法と比較して、サンプル量が少ない1 pg ML-1の定量化（LLOQ）に達する可能性があり、サンプルの調製は自動化された液体処理システムによって簡単に実行でき、微量レベルの内因性メラトニン測定に関する大規模な集団コホート研究により適していました。

The level of melatonin in human milk might be closely related to infant development and the building up of their circadian rhythms. The large population investigation on this topic would provide insights for the prevention and treatment of diseases related to early development and circadian rhythms. However, it has not been well studied. Trace level endogenous melatonin and difficulties in sample collection are among the challenges limiting the progress. High throughput analytical method with high specificity and sensitivity to determine the endogenous melatonin concentration is highly desired. A newly developed easily operated and high-throughput sensitive on-line enrichment liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method would be reported in this paper. Melatonin-d3 (MEL-d3) was used as a surrogate standard for the calibration curve and melatonin-d4 (MEL-d4) was used as an internal standard. Sample preparation was simply performed in 96-well plate by protein precipitation using acetonitrile (ACN). The supernatant was injected directly into the easily configured LC-MS/MS system with an enlarged sample loop and a mixer. Positive mode multiple reaction monitoring (MRM) was adopted for the measurement of melatonin in milk. 100 μL sample was used for analysis and the calibration curve linear range was 1-1000 pg mL-1. In three validation batches, the accuracy was within 11.0% deviation from the relative nominal concentration, whereas the intra- and inter-assay precision was ≤4.1% and ≤6.8% relative standard deviation (RSD), respectively. Although matrix effect was observed in the validation experiments, the stable isotope labeled internal standard (MEL-d4) could correct it and the overall relative matrix effect of MEL-d3/MEL-d4 was close to 100%. The overall spike recovery of the method was 101.7% with 5.1% RSD. Compared to currently reported methods, it could reach 1 pg mL-1 lower limit of quantification (LLOQ) with a smaller sample volume, sample preparation could be easily performed by automated liquid handling system and was more suitable for large population cohort studies on trace level endogenous melatonin determination.