サイトゾルおよびリソソームのpH条件での切断の好みに基づいて設計されたカテプシンBの選択中性pH阻害剤

カテプシンBは、タンパク質分解のために通常酸性リソソーム内で機能するシステインプロテアーゼですが、多くのヒト疾患では、カテプシンBは酵素が炎症と細胞死を活性化する中性pHを持つ細胞ゾルに移行します。カテプシンBは、リソソーム内のサイトゾルの中性pH 7.2と酸性pH 4.6の両方で活性化されています。カテプシンBは、（1）質量によるマルチプレックスサブストラートプロファイルを使用して酸性pHと比較して中性pHでの微分カテプシンB切断プロファイルの分析により、選択的中性pH阻害剤の設計に使用できるpH依存性切断の好みを持っている可能性があるという仮説を評価しました。分光測定（MSP-MS）、（2）pH選択ペプチド-7-アミノ-4-メチルクマリン（AMC）基質の設計、および（3）Z-Arg-Lys-アシロキシメチルケトン（AOMK）の設計と検証選択的中性pH阻害剤。カテプシンBは、PH 7.2のP2位置でARGを使用してペプチドを切断するための好みを示し、pH 4.6のP2位置でGLUを示しました。これらの特性は、中性pH選択性を有する基質Z-ARG-LYS-AMCの設計と、AOMK弾頭でのその修飾が阻害剤Z-Arg-Lys-aomkをもたらすことにつながりました。この不可逆的な阻害剤は、pH 4.6と比較してpH 7.2でのカテプシンBの阻害のための100倍の選択性を備えたナノモル極効力を示し、他のシステインカテプシンに対するカテプシンBの特異性を示し、細胞透過性であり、細胞内カテプシンBを阻害します。これらの発見は、カテプシンBを示しています。この酵素の強力で中性pH阻害剤の開発につながる可能性のあるpH依存性切断特性を持っています。

Cathepsin B is a cysteine protease that normally functions within acidic lysosomes for protein degradation, but in numerous human diseases, cathepsin B translocates to the cytosol having neutral pH where the enzyme activates inflammation and cell death. Cathepsin B is active at both the neutral pH 7.2 of the cytosol and the acidic pH 4.6 within lysosomes. We evaluated the hypothesis that cathepsin B may possess pH-dependent cleavage preferences that can be utilized for design of a selective neutral pH inhibitor by (1) analysis of differential cathepsin B cleavage profiles at neutral pH compared to acidic pH using multiplex substrate profiling by mass spectrometry (MSP-MS), (2) design of pH-selective peptide-7-amino-4-methylcoumarin (AMC) substrates, and (3) design and validation of Z-Arg-Lys-acyloxymethyl ketone (AOMK) as a selective neutral pH inhibitor. Cathepsin B displayed preferences for cleaving peptides with Arg in the P2 position at pH 7.2 and Glu in the P2 position at pH 4.6, represented by its primary dipeptidyl carboxypeptidase and modest endopeptidase activity. These properties led to design of the substrate Z-Arg-Lys-AMC having neutral pH selectivity, and its modification with the AOMK warhead to result in the inhibitor Z-Arg-Lys-AOMK. This irreversible inhibitor displays nanomolar potency with 100-fold selectivity for inhibition of cathepsin B at pH 7.2 compared to pH 4.6, shows specificity for cathepsin B over other cysteine cathepsins, and is cell permeable and inhibits intracellular cathepsin B. These findings demonstrate that cathepsin B possesses pH-dependent cleavage properties that can lead to development of a potent, neutral pH inhibitor of this enzyme.