3-デヒドロキン酸塩シンターゼおよびデヒドラターゼの機械的意味における同位体効果

3-デヒドロキン酸シンターゼのメカニズムは、[1-14C] 3-デオキシ-D-アラビノ - ヘプロソン酸7-リン酸（DAHP）および特異的に三位一体の基質[4-3H]の混合物と部分的に精製された酵素をインキュベートすることにより、調査されました[4-3H]DAHP、[5-3H] DAHP、[6-3H] DAHP、（7RS） - [7-3H] DAHP、（7R） - [7-3H] DAHP、または（7S） - [7-3H] DAHP。速度論的および二次3H同位体効果は、未反応のDAHP、3-デヒドロキン酸塩、および3-デヒドロシキメートで得られた3H：14C比から計算されました。3Hは培地から3-デヒドロキン酸塩に組み込まれておらず、C-7のカルバニオン（またはメチル基）が形成されていないことを示しています。1.7の運動同位体効果KH/K3HがC-5で観察され、NADによるC-5の酸化を含むメカニズムのサポートを提供しました。同様の運動同位体効果は、リン酸の除去におけるプロトンの除去により、C-6で発見されました。DAHPのC-7の水素は、反応の環化ステップで失われず、リン酸除去で形成されたENOLがC-2でカルボニルとのアルドラーゼ型反応に直接関与したことを示しています。3-デヒドロシュートの3-デヒドロシキメートに（7R） - または（7R） - [7-3H] DAHPから（7R）プロトンが失われ、7Rプロトンがデヒドロキン酸塩の2R位置を占めることを示しています。したがって、環化ステップは、C-7での構成の反転とともに発生します。（2R） - [2-3H]脱水症への変換で、運動同位体効果kh/k3H = 2.3が観察されました。したがって、酵素とヒヒドロを促進するイミンからのプロトンの喪失は、反応の速度制限に寄与しました。

The mechanism of 3-dehydroquinate synthase was explored by incubating partially purified enzyme with mixtures of [1-14C]3-deoxy-D-arabino-heptulosonic acid 7-phosphate (DAHP) and one of the specifically tritiated substrates [4-3H]DAHP, [5-3H]DAHP, [6-3H]DAHP, (7RS)-[7-3H]DAHP, (7R)-[7-3H]DAHP, or (7S)-[7-3H]DAHP. Kinetic and secondary 3H isotope effects were calculated from 3H:14C ratios obtained in unreacted DAHP, 3-dehydroquinate, and 3-dehydroshikimate. 3H was not incorporated from the medium into 3-dehydroquinate, indicating that a carbanion (or methyl group) at C-7 is not formed. A kinetic isotope effect kH/k3H of 1.7 was observed at C-5, and afforded support for a mechanism involving oxidation of C-5 with NAD. A similar kinetic isotope effect was found at C-6 owing to removal of a proton in elimination of phosphate, which is reasonably assumed to be the next step in 3-dehydroquinate synthase. Hydrogen at C-7 of DAHP was not lost in the cyclization step of the reaction, indicating that the enol formed in phosphate elimination participated directly in an aldolase-type reaction with the carbonyl at C-2. In the dehydration of 3-dehydroquinate to 3-dehydroshikimate the (7R) proton from (7RS)- or (7R)-[7-3H]DAHP is lost, indicating that the 7R proton occupies the 2R position in dehydroquinate. Hence the cyclization step occurs with inversion of configuration at C-7. A kinetic isotope effect kH/k3H = 2.3 was observed in the conversion of (2R)-[2-3H]dehydroquinate to dehydroshikimate. Hence loss of a proton from the enzyme-dehydroquinate imine contributed to rate limitation in the reaction.