CRISPR-CAS9を介したヌル変異を生成し、ヒト多能性幹細胞におけるスクリーニングターゲティング効率

CRISPR-CAS9変異誘発は、多くの発達的および細胞的文脈における遺伝子機能の調査を促進します。胚または誘導のいずれかのヒト多能性幹細胞（HPSC）は、初期の人間の発達と細胞運命の決定に関与する分子メカニズムを調査するための扱いやすい細胞モデルです。HPSCは、再生医療でも疾患をモデル化、調査、改善する可能性が広いです。ここでは、HPSCの効率的なCRISPR-CAS9ゲノム編集のための最適化されたプロトコルを提供して、ヌル変異を操作することにより遺伝子の機能的役割を調査します。単一ガイドRNA（SGRNA）をスクリーニングすることの重要性を強調して、クローン由来のヌル変異体hPSC系統の生成のためのターゲティング効率が高いものを特定します。HPSCメンテナンスに役割を果たす可能性のある遺伝子をターゲットにするための重要な考慮事項を提供します。また、ターゲット変異スペクトルと意図しない核型の変化を評価する方法も提示します。©2021著者。Wiley Repionicals LLCが発行した現在のプロトコル。基本プロトコル1：SGRNAを発現プラスミドに選択および並べる基本プロトコル2：in vitro転写および切断アッセイ基本プロトコル3：プライミングヒト胚性幹細胞のヌクレオフェクション基礎プロトコル4：インデル変異プロトコルのMISEQ分析基本プロトコル5：単一標的HPSCの細胞クローニング基本プロトコル6：標的HPSCの核型。

CRISPR-Cas9 mutagenesis facilitates the investigation of gene function in a number of developmental and cellular contexts. Human pluripotent stem cells (hPSCs), either embryonic or induced, are a tractable cellular model to investigate molecular mechanisms involved in early human development and cell fate decisions. hPSCs also have broad potential in regenerative medicine to model, investigate, and ameliorate diseases. Here, we provide an optimized protocol for efficient CRISPR-Cas9 genome editing of hPSCs to investigate the functional role of genes by engineering null mutations. We emphasize the importance of screening single guide RNAs (sgRNAs) to identify those with high targeting efficiency for generation of clonally derived null mutant hPSC lines. We provide important considerations for targeting genes that may have a role in hPSC maintenance. We also present methods to evaluate the on-target mutation spectrum and unintended karyotypic changes. © 2021 The Authors. Current Protocols published by Wiley Periodicals LLC. Basic Protocol 1: Selecting and ligating sgRNAs into expression plasmids Basic Protocol 2: Validation of sgRNA via in vitro transcription and cleavage assay Basic Protocol 3: Nucleofection of primed human embryonic stem cells Basic Protocol 4: MiSeq analysis of indel mutations Basic Protocol 5: Single cell cloning of targeted hPSCs Basic Protocol 6: Karyotyping of targeted hPSCs.