ヒト血漿中のメトトレキサートの定量化のためのLC-MS3およびLC-MRM戦略と治療薬モニタリングにおけるその応用の比較

シンプルで高度に選択的で高スループット液体クロマトグラフィータンデム質量分析Cubed（LC/MS3）メソッドが開発され、ヒト血漿中のメトトレキサートの定量化のために検証されました。MS3検出は、QTRAP MSシステムまたはイオントラップMSシステムのスキャンモードです。メタノールによる単純なタンパク質沈殿後、メトトレキサートおよびメトトレキサートD3をアジャイル溶液120 SB-C18カラム（4.6×50 mm、2.7 µM）で分離しました。流量は0.8 ml/minです。陽性イオンモードでのMS3検出は、メトトレキサートの定量化にはM/Z 455.2→308.2→175.1でMRM3遷移を使用し、M/Z 458.2→311.2→175.1メトトレキサートD3の定量化には使用しました。合計実行時間は、各サンプルでわずか3分でした。LC/MS3アッセイは、濃度範囲10-3000 ng/mL（R2≥0.995）で線形であり、日中および日中の精度は3.72％未満で、精度はすべての濃度で<7.78％でした。ヒト血漿中のメトトレキサートの絶対回収率（％）およびマトリックス効果（％）は92.6〜114.3でした。提示された方法論の斬新さは、MS3技術であり、その結果、選択性と感度が向上します。このLC-MS3メソッドの適用は、46のヒト血漿サンプルで正常に完了し、同一のヒト血漿サンプルの定量的結果を別のLC-MRMベースの方法と比較しました。Passing-Bablok回帰係数は、LC-MS3メソッドとLC-MRMメソッドの間に有意差がないことを実証しました。Bland-Altmanプロットは、開発されたLC-MS3メソッドをサポートする一致の結果を示しました。ヒト血漿中のメトトレキサートの測定のための信頼できる正確なアッセイです。この作業は、LC-MS3技術を使用して生物学的サンプル中の化学物質を測定するための概念の証明でもあります。

A simple, highly selective and high throughput liquid chromatography tandem mass spectrometry cubed (LC/MS3) method was developed and validated for quantification of methotrexate in human plasma. The MS3 detection is a scanning mode of QTrap MS systems or ion trap MS systems. After simple protein precipitation with methanol, methotrexate and methotrexate-d3 were separated on an Agilent Poroshell 120 SB-C18 column (4.6 × 50 mm, 2.7 µm) using isocratic elution with a mobile phase consisting of 60% 0.1% formic acid in water and 40% 0.1% formic acid in acetonitrile. The flow rate is 0.8 mL/min. MS3 detection in positive ion mode used the MRM3 transitions at m/z 455.2→308.2→175.1 for quantification of methotrexate and m/z 458.2→311.2→175.1 for quantification of methotrexate-d3. The total run time was only 3 min for each sample. The LC/MS3 assay was linear in the concentration range 10-3000 ng/mL(R2 ≥ 0.995) and the intra- and inter-day accuracies were< 3.72% and precisions were< 7.78% at all concentrations. The absolute recoveries (%) and matrix effect (%) for methotrexate in human plasma were between 92.6 and 114.3. The novelty of the presented methodology is the MS3 technique resulting in enhanced selectivity and sensitivity. The application of this LC-MS3 method was successfully completed on 46 human plasma samples and the quantitative results of identical human plasma samples were compared with another LC-MRM based method. Passing-Bablok regression coefficients demonstrated that there is no significant difference between the LC-MS3 method and LC-MRM method. Bland-Altman plots showed a concordant results, supporting the developed LC-MS3 method is a reliable and accurate assay for determination of methotrexate in human plasma. This work is also a proof of concept for using LC-MS3 technique to determination of chemicals in biological samples.