DNAブレイクでの最終保護とDNA合成における53bp1の役割

二本鎖切断（DSB）修復の選択は、DNA端の初期処理によって大きな影響を受けます。53BP1は、BRCA1欠損細胞における組換え生成単一鎖DNA（SSDNA）の形成を制限し、相同組換え（HR）の欠陥をもたらします。ただし、53bp1がDSB切除を阻害する正確なメカニズムは不明のままです。以前の研究では、2つの潜在的な経路が特定されています。おそらく、SSDNAへのシエルチン（SHLD）複合体結合を介したDNA2/EXO1エキソヌクレアーゼと、CTC1-STN1-TEN1（CST）とDNAポリメラーゼα（POLα）を介した局所的なDNA合成を介した局所DNA合成を介して局所的なDNA合成を介して局所化します。。エンドシュー、SAR-seq、およびRPAチップスケの組み合わせアプローチを使用して、制限酵素誘発DSBで、それぞれ切除、DNA合成、およびSSDNAの程度を直接評価しました。53BP1の存在下で、POLα依存性DNA合成により、切除されたDSBの割合とG0/G1の切除長が減少し、埋め込まれた合成が切除の範囲を制限できるという以前のモデルをサポートすることが示されます。ただし、53bp1が存在しない場合、Polα活性はSsDNAで維持されていますが、実質的に切除を逆にしません。対照的に、EXO1ヌクレアーゼ活性は、53bp1の非存在下での過隔離に不可欠です。したがって、Polαを介した充填は、53bp1の存在下で部分的に部分的に限界を制限しますが、53bp1エキソヌクレアーゼ遮断の損失のために広範囲にわたる高隔離に対抗することはできません。これらのデータは、切除されたDSBでのDNA合成の最初のヌクレオチドマッピングを提供し、フィルインポリメラーゼと切除エキソヌクレアーゼとの関係についての洞察を提供します。

Double-strand break (DSB) repair choice is greatly influenced by the initial processing of DNA ends. 53BP1 limits the formation of recombinogenic single-strand DNA (ssDNA) in BRCA1-deficient cells, leading to defects in homologous recombination (HR). However, the exact mechanisms by which 53BP1 inhibits DSB resection remain unclear. Previous studies have identified two potential pathways: protection against DNA2/EXO1 exonucleases presumably through the Shieldin (SHLD) complex binding to ssDNA, and localized DNA synthesis through the CTC1-STN1-TEN1 (CST) and DNA polymerase α (Polα) to counteract resection. Using a combinatorial approach of END-seq, SAR-seq, and RPA ChIP-seq, we directly assessed the extent of resection, DNA synthesis, and ssDNA, respectively, at restriction enzyme-induced DSBs. We show that, in the presence of 53BP1, Polα-dependent DNA synthesis reduces the fraction of resected DSBs and the resection lengths in G0/G1, supporting a previous model that fill-in synthesis can limit the extent of resection. However, in the absence of 53BP1, Polα activity is sustained on ssDNA yet does not substantially counter resection. In contrast, EXO1 nuclease activity is essential for hyperresection in the absence of 53BP1. Thus, Polα-mediated fill-in partially limits resection in the presence of 53BP1 but cannot counter extensive hyperresection due to the loss of 53BP1 exonuclease blockade. These data provide the first nucleotide mapping of DNA synthesis at resected DSBs and provide insight into the relationship between fill-in polymerases and resection exonucleases.