Bioid2ベースの近接標識による新規ミッドキン結合タンパク質のスクリーニング

ヘパリン結合成長因子であるミッドキン（MK）は、小児腫瘍の神経芽細胞腫の予後不良に関連しています。多くの研究が腫瘍の発達を抑制したさまざまな癌におけるその機能の阻害を示したため、MKは麻薬可能な標的となります。MKを標的とする治療を確立するには、その拘束力のあるパートナーの特定、およびその細胞内シグナル伝達の解明が必要です。外因性MKは、MTORシグナル伝達の下流にリボソームタンパク質S6（RPS6）のリン酸化を誘導したことが報告されました。RPS6リン酸化をMK応答のマーカーとして使用して、MK反応性細胞株を検索しました。MKを発現するMK細胞株は、MKによりよく反応する傾向があることがわかりました。次に、MK反応性神経芽細胞腫細胞株を使用して、SH-SY5Y細胞を閉じ込めて、ビオチン化によるタンパク質 - タンパク質相互作用を評価するために発明された近接依存性ビオチン同定法を採用しました。ビオチンリガーゼバイオイド2（MK-ビオイド2）に融合した分泌されたMKが細胞からタンパク質をビオチン化することができることを確認しました。ビオチン化タンパク質は、液体クロマトグラフィー質量分析分析によって同定されました。3回の独立した実験の後、25個のタンパク質が重複していることがわかりました。その中で、インスリン様成長結合タンパク質2（IGFBP2）がさらに分析されました。IGFBP2は、MK-Bioid2標識細胞抽出物のSH-SY5Y細胞の標識細胞抽出物のストレプトアビジンプルダウン後、実際に免疫ブロットで検出されました。私たちの研究は、バイオイド法が成長因子の結合パートナーを特定するのに役立つことを示唆しています。

Midkine (MK), a heparin-binding growth factor, is associated with the poor prognosis of the pediatric tumor, neuroblastoma. MK would be a druggable target as many studies showed inhibition of its function in various cancers suppressed tumor developments. To establish the therapy targeting MK, identification of its binding partners, and elucidation of its intracellular signaling are needed. It was reported that exogenous MK induced phosphorylation of ribosomal protein S6 (RPS6) downstream of mTOR signaling. Using RPS6 phosphorylation as a marker of MK response, we searched for MK reactive cell lines. We found that MK cell lines expressing less MK tended to respond better to MK. Next, using an MK reactive neuroblastoma cell line, MK-knocked down SH-SY5Y cells, we employed a proximity-dependent biotin identification method, which was invented to evaluate protein-protein interactions by biotinylation. We confirmed that secreted MK fused to the biotin ligase BioID2 (MK-BioID2) was able to biotinylate proteins from the cells. Biotinylated proteins were identified by liquid chromatography-mass spectrometry analyses. Twenty five proteins were found to be overlapped after three independent experiments, among which insulin-like growth binding protein 2 (IGFBP2) was further analyzed. IGFBP2 was indeed detected with immunoblotting after streptavidin pull down of MK-BioID2 labeled cell extract of MK-knocked down SH-SY5Y cells. Our study suggests that the BioID2 method is useful to identify binding partners of growth factors.