P53活性化と腫瘍抑制のためのMDM2およびMDMXの超親和性と二重特異性ペプチド拮抗薬の設計

ペプチド阻害腫瘍抑制タンパク質P53とその陰性調節因子MDM2およびMDMXとの相互作用は、in vitroおよびin vivoでp53を活性化し、癌治療のための実行可能な治療戦略を表します。ファージディスプレイ技術を使用して、PMI（TSFAEYWNLLSP）と呼ばれるp53の強力なペプチド活性化因子を以前に特定しました。ここでは、系統的変異分析と添加剤ベースの分子設計を通じて得られたMDM2およびMDMXの超高性度、二重特異性ペプチド拮抗薬を報告します。表面プラズモン共鳴および蛍光偏光技術を使用したPMIの100ペプチド類似体の機能アッセイは、等植物濃度濃度のカルオリメトル測定によって検証された低ピコモル濃度範囲のK D値でMDM2およびMDMXに結合したMDM2およびMDMXに結合したMDM2およびMDMXに結合するMDM2およびMDMXと呼ばれるdodecAmericペプチドを生成しました。PMI-M3と複合したMDM2およびMDMXの共結晶構造は、それぞれ1.65および3.0Åの解像度で解決されました。PMIと同様に、PMI-M3はMDM2/MDMXのp53結合ポケットを占めました。これは、PHE3、Tyr6、Trp7、およびLeu10を含む分子間相互作用によってエネルギー的に支配されていました。PMI-M3とPMI間の結合の顕著な違いは、MDM2、MDM2、およびLEU1およびMET11などの他の位置でMDMXを伴う他の位置で観察され、両方のタンパク質のPMI-M3の結合親和性が大幅に強化されたものに貢献しました。PMIとPMI-M3の両端にリジン残基を加えて細胞の取り込みを改善することにより、PMI-2K（Ktsfaeywnllspk）とM3-2K（Kltfleywaqlmqk）と呼ばれる修飾ペプチドを取得しました。PMI-2Kと比較して、M3-2Kは、in vitroおよびin vivoでP53依存的に大幅に改善された抗腫瘍活性を示しました。P53-MDM2/MDMX相互作用のこの超強力なペプチド阻害剤は、それ自体が抗がん薬開発の強力なリード化合物になる可能性があり、抗がん療法のために他のクラスのP53活性化因子の分子設計を支援することができます。

Peptide inhibition of the interactions of the tumor suppressor protein P53 with its negative regulators MDM2 and MDMX activates P53 in vitro and in vivo, representing a viable therapeutic strategy for cancer treatment. Using phage display techniques, we previously identified a potent peptide activator of P53, termed PMI (TSFAEYWNLLSP), with binding affinities for both MDM2 and MDMX in the low nanomolar concentration range. Here we report an ultrahigh affinity, dual-specificity peptide antagonist of MDM2 and MDMX obtained through systematic mutational analysis and additivity-based molecular design. Functional assays of over 100 peptide analogs of PMI using surface plasmon resonance and fluorescence polarization techniques yielded a dodecameric peptide termed PMI-M3 (LTFLEYWAQLMQ) that bound to MDM2 and MDMX with K d values in the low picomolar concentration range as verified by isothermal titration calorimetry. Co-crystal structures of MDM2 and of MDMX in complex with PMI-M3 were solved at 1.65 and 3.0 Å resolution, respectively. Similar to PMI, PMI-M3 occupied the P53-binding pocket of MDM2/MDMX, which was dominated energetically by intermolecular interactions involving Phe3, Tyr6, Trp7, and Leu10. Notable differences in binding between PMI-M3 and PMI were observed at other positions such as Leu4 and Met11 with MDM2, and Leu1 and Met11 with MDMX, collectively contributing to a significantly enhanced binding affinity of PMI-M3 for both proteins. By adding lysine residues to both ends of PMI and PMI-M3 to improve their cellular uptake, we obtained modified peptides termed PMI-2K (KTSFAEYWNLLSPK) and M3-2K (KLTFLEYWAQLMQK). Compared with PMI-2K, M3-2K exhibited significantly improved antitumor activities in vitro and in vivo in a P53-dependent manner. This super-strong peptide inhibitor of the P53-MDM2/MDMX interactions may become, in its own right, a powerful lead compound for anticancer drug development, and can aid molecular design of other classes of P53 activators as well for anticancer therapy.