マルチモーダルクロマトグラフィーにおける選択性に対する二重特異性抗体のドメイン貢献を研究するための体系的なワークフロー

この記事では、3つのマルチモーダル陽イオン交換樹脂システムでの二重特異的モノクローナル抗体（mAb）およびその親mabの選択性の違いと優先結合パッチを理解するために、体系的なワークフローが策定され、実装されました。このワークフローには、親mabとその断片のクロマトグラフィースクリーニングが、さまざまなpHでの断片が組み込まれています。その後、共有標識を使用した表面特性マッピングとタンパク質フットプリントに続いて、液体クロマトグラフィーマス分光測定分析が行われます。無傷のMABを伴うマルチモーダル樹脂のクロマトグラフィースクリーンは、シングルモード相互作用システムと比較して選択性が強化されたことを示しました。樹脂のほとんどで2つの親mabの間で溶出された二重特異的抗体（BSAB）は、1つの親mabとの共溶出からCapto MMCの他の親mabに共溶出することから遷移しました。異なるドメインの寄与を調査するために、mAbフラグメントを評価し、結果は、相互作用がより高いpHのFABドメインによって支配される可能性が高いことを示しました。次に、親FABSの溶媒曝露領域の潜在的な優先結合パッチを仮定するために、タンパク質表面特性マップを使用しました。最後に、親mabsとBSABがpH 7.5のバインドされたバインド状態と非バインド状態で、好ましい結合パッチを識別してタンパク質フットプリントを実行しました。無傷のMAB分析での結果は、樹脂との相互作用は主にFCではなくFabフラグメントの残基によって駆動されるという仮説をサポートしました。さらに、ペプチドマッピングデータは、これらの樹脂システムの親Bと比較して、親Aのより高い結合において軽鎖がより重要な役割を果たしている可能性があることを示しました。最後に、BSABの結果は、親mabと比較して微妙な違いがあるにもかかわらず、分子の両方の分子が樹脂との結合に寄与したことを示しました。このペーパーで提示されているワークフローは、大規模なマルチドメイン分子のクロマトグラフィー選択性を体系的に研究するための基礎を築き、バイオ製造性の改善と迅速な下流のバイオプロセスの発達に関する洞察を提供できます。

In this article, a systematic workflow was formulated and implemented to understand selectivity differences and preferred binding patches for bispecific monoclonal antibodies (mAbs) and their parental mAbs on three multimodal cation exchange resin systems. This workflow incorporates chromatographic screening of the parent mAbs and their fragments at various pH followed by surface property mapping and protein footprinting using covalent labeling followed by liquid chromatography-mass spectrometry analysis. The chromatography screens on multimodal resins with the intact mAbs indicated enhanced selectivity as compared to single-mode interaction systems. While the bispecific antibody (bsAb) eluted between the two parental mAbs on most of the resins, the retention of the bispecific transitioned from co-eluting with one parental mAb to the other parental mAb on Capto MMC. To investigate the contribution of different domains, mAb fragments were evaluated and the results indicated that the interactions were likely dominated by the Fab domain at higher pH. Protein surface property maps were then employed to hypothesize the potential preferred binding patches in the solvent-exposed regions of the parental Fabs. Finally, protein footprinting was carried out with the parental mAbs and the bsAb in the bound and unbound states at pH 7.5 to identify the preferred binding patches. Results with the intact mAb analysis supported the hypothesis that interactions with the resins were primarily driven by the residues in the Fab fragments and not the Fc. Furthermore, peptide mapping data indicated that the light chain may be playing a more important role in the higher binding of Parent A as compared with Parent B in these resin systems. Finally, results with the bsAb indicated that both halves of the molecule contributed to binding with the resins, albeit with subtle differences as compared to the parental mAbs. The workflow presented in this paper lays the foundation to systematically study the chromatographic selectivity of large multidomain molecules which can provide insights into improved biomanufacturability and expedited downstream bioprocess development.