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10個のアミノ酸（AA）（RifiHFRIGC）で構成される細胞浸透ペプチド（CPP）である核輸送ペプチド（NTP）は、強力な核輸送活動を持っています。最近、NTPを使用してタンパク質ベースの細胞工学システムを確立しましたが、NTPが核配向を持つCPPとしてどのように機能するかはとらえどころのないままでした。本研究では、インポートサブユニットβ1（IMB1）およびTransportin 1（TNPO1）をNTPの活性の根底にある細胞タンパク質として特定しました。これらのカリオフェリン核輸送受容体は、液体クロマトグラフィー/質量分析分析により候補分子として同定され、小さな干渉RNAによる各タンパク質のダウンレギュレーションがNTP活性を有意に減少させました（P <0.01）。生化学的分析により、NTPは両方の分子に直接結合し、IMB1フラグメント（296-516 AA）またはTNPO1フラグメント（1-297 AA）の強制発現がNTPへの結合部位を含むことが明らかになり、NTPへの結合部位が還元された核NTP緑色蛍光タンパク質の減少が明らかになりました。（GFP）細胞培養培地に追加されたときのレベル。NTPは、ヒト免疫不全ウイルス1のウイルスタンパク質R（VPR）に由来し、VPRは核に入り、多面的な機能を発揮します。特に、VPRはIMB1およびTNPO1に直接結合し、その機能は、IMB1の296-516-AAフラグメントとTNPO1の1-297-AAフラグメントの強制発現によって著しく損なわれました。興味深いことに、NTPはVPRとIMB1およびTNPO1との物理的関連を完全にブロックしました。VPRの核局在メカニズムは不明のままですが、我々のデータは、NTPがVPRの新規核局在信号として機能することを示唆しています。
10個のアミノ酸（AA）（RifiHFRIGC）で構成される細胞浸透ペプチド（CPP）である核輸送ペプチド（NTP）は、強力な核輸送活動を持っています。最近、NTPを使用してタンパク質ベースの細胞工学システムを確立しましたが、NTPが核配向を持つCPPとしてどのように機能するかはとらえどころのないままでした。本研究では、インポートサブユニットβ1（IMB1）およびTransportin 1（TNPO1）をNTPの活性の根底にある細胞タンパク質として特定しました。これらのカリオフェリン核輸送受容体は、液体クロマトグラフィー/質量分析分析により候補分子として同定され、小さな干渉RNAによる各タンパク質のダウンレギュレーションがNTP活性を有意に減少させました（P <0.01）。生化学的分析により、NTPは両方の分子に直接結合し、IMB1フラグメント（296-516 AA）またはTNPO1フラグメント（1-297 AA）の強制発現がNTPへの結合部位を含むことが明らかになり、NTPへの結合部位が還元された核NTP緑色蛍光タンパク質の減少が明らかになりました。（GFP）細胞培養培地に追加されたときのレベル。NTPは、ヒト免疫不全ウイルス1のウイルスタンパク質R（VPR）に由来し、VPRは核に入り、多面的な機能を発揮します。特に、VPRはIMB1およびTNPO1に直接結合し、その機能は、IMB1の296-516-AAフラグメントとTNPO1の1-297-AAフラグメントの強制発現によって著しく損なわれました。興味深いことに、NTPはVPRとIMB1およびTNPO1との物理的関連を完全にブロックしました。VPRの核局在メカニズムは不明のままですが、我々のデータは、NTPがVPRの新規核局在信号として機能することを示唆しています。
Nuclear trafficking peptide (NTP), a cell-penetrating peptide (CPP) composed of 10 amino acids (aa) (RIFIHFRIGC), has potent nuclear trafficking activity. Recently, we established a protein-based cell engineering system by using NTP, but it remained elusive how NTP functions as a CPP with nuclear orientation. In the present study, we identified importin subunit β1 (IMB1) and transportin 1 (TNPO1) as cellular proteins underlying the activity of NTP. These karyopherin nuclear transport receptors were identified as candidate molecules by liquid chromatography/mass spectrometry analysis, and downregulation of each protein by small interfering RNA significantly reduced NTP activity (P < 0.01). Biochemical analyses revealed that NTP bound directly to both molecules, and the forced expression of an IMB1 fragment (296-516 aa) or TNPO1 fragment (1-297 aa), which both contain binding sites to NTP, reduced nuclear NTP-green fluorescent protein (GFP) levels when it was added to cell culture medium. NTP is derived from viral protein R (Vpr) of human immunodeficiency virus-1, and Vpr enters the nucleus and exerts pleiotropic functions. Notably, Vpr bound directly to IMB1 and TNPO1, and its function was significantly impaired by the forced expression of the 296-516-aa fragment of IMB1 and 1-297-aa fragment of TNPO1. Interestingly, NTP completely blocked the physical association of Vpr with IMB1 and TNPO1. Although the nuclear localization mechanism of Vpr remains unknown, our data suggest that NTP functions as a novel nuclear localization signal of Vpr.
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