キナクリンは、小胞ATP貯蔵のための重要な蛍光プローブではありません

蛍光欠子性アミンであるキナクリンは、プリン作動性シグナル伝達の分野でATPの小胞貯蔵を視覚化するための重要な蛍光プローブとして使用されています。ただし、キナクリンが小胞ATP貯蔵を表すメカニズムは明らかにされていない。本研究では、ATP貯蔵オルガネラのバイアル蛍光プローブとしてのキナクリンの使用の妥当性を調査しました。小胞貯蔵およびATP放出に不可欠な成分である小胞ヌクレオチド輸送体（VNUT）は、肝細胞の非常に低密度リポタンパク質（VLDL）を含む分泌小胞に存在します。VNUT遺伝子ノックアウト（VNUT - / - ）またはvNUT阻害剤であるクロドロネート治療は、小胞ATP放出を消滅させました（Tatsushima et al。、Biochim Biophys Acta Molecular Basic of Disease 2021、E166013）。マウスの原発性肝細胞がインキュベートすると、キナクリンは粒状パターンで細胞質に蓄積し、0.1μmバフィロマイシンA1に敏感で、液胞ATPase（V-ATPase）阻害剤を蓄積します。vNUT - / - も、クロドロネートの治療に影響を与えなかったキナクリン顆粒蓄積はありません。in vitroでは、キナクリンは、ATPの有無に関係なく、酸性膜貫通pH勾配（∆PH）を課すとリポソームに蓄積されます。VNUTでのATP結合も、ATPのVNUTを介した取り込みもキナクリンの影響を受けませんでした。一貫して、キナクリンのVNUTを介した取り込みは無視できましたまたは検出限界下にありました。これらの結果から、小胞キナクリンの蓄積は、ATPとの相互作用の結果ではなく、両親媒性アミンとしての膜全体の∆ph駆動濃度によるものであると結論付けられています。したがって、キナクリンは小胞ATP貯蔵のための重要な蛍光プローブではありません。

Quinacrine, a fluorescent amphipathic amine, has been used as a vital fluorescent probe to visualize vesicular storage of ATP in the field of purinergic signaling. However, the mechanism(s) by which quinacrine represents vesicular ATP storage remains to be clarified. The present study investigated the validity of the use of quinacrine as a vial fluorescent probe for ATP-storing organelles. Vesicular nucleotide transporter (VNUT), an essential component for vesicular storage and ATP release, is present in very low density lipoprotein (VLDL)-containing secretory vesicles in hepatocytes. VNUT gene knockout (Vnut-/-) or clodronate treatment, a VNUT inhibitor, disappeared vesicular ATP release (Tatsushima et al., Biochim Biophys Acta Molecular Basis of Disease 2021, e166013). Upon incubation of mice's primary hepatocytes, quinacrine accumulates in a granular pattern into the cytoplasm, sensitive to 0.1-μM bafilomycin A1, a vacuolar ATPase (V-ATPase) inhibitor. Neither Vnut-/- nor treatment of clodronate affected quinacrine granular accumulation. In vitro, quinacrine is accumulated into liposomes upon imposing inside acidic transmembranous pH gradient (∆pH) irrespective of the presence or absence of ATP. Neither ATP binding on VNUT nor VNUT-mediated uptake of ATP was affected by quinacrine. Consistently, VNUT-mediated uptake of quinacrine was negligible or under the detection limit. From these results, it is concluded that vesicular quinacrine accumulation is not due to a consequence of its interaction with ATP but due to ∆pH-driven concentration across the membranes as an amphipathic amine. Thus, quinacrine is not a vital fluorescent probe for vesicular ATP storage.