エキソリボヌクレアーゼXRN-1による8-オキソ-7,8-ジヒドログアノシン（8-オキソグ）を含むRNAの処理

酸化的に損傷したRNAが細胞内にどのように処理されるかを理解することは、酸化RNAといくつかの疾患の進行/発達と老化との間のリンクにより、関連性があります。修飾（化学的または天然）の崩壊の原因となるリボヌクレアーゼの中には、5'→3 '方向の5'リン酸化RNAの加水分解を触媒するプロセス酵素であるエキソヌクレアーゼXRN-1です。固相合成を介して得られた8-oxo-7,8-ジヒドログアノシン（8-オキソグ）を含むRNAを含むRNAのオリゴヌクレオチド（ONS、20 ntから30 ntの長さ）に向けたこのエキソヌクレアーゼの反応性を調査することに着手しました。結果は、XRN-1が、標準的な類似体で観察されたものよりも（電気泳動分析を介して）動く帯域が遅いことによって証明される8-オキソグを含む部位で失速したことを示しています。観察されたフラグメントは、オリゴヌクレオチドフラグメントが5'リン酸化8-オキソグを含むことを確認するために、ページとMaldi-TOFを介して特徴付けられました。さらに、この失速の利回りはアプリとは異なります。異なる位置と異なるシーケンスにある8オキソグで5〜30％。ヌクレアーゼ効率の低下をよりよく理解するために、私たちは次のことを調査しました。1）H結合と空間的制約。2）抗シン立体構造の変化。3）二重陽イオンの濃度。および4）二次構造。これは、メチル化または臭素化プリン（M1G、M6,6A、または8-BRG）を導入し、さまざまな[Mg2+]を調査することで実行され、構造化されたRNAの形成を探求するために円形二色（CD）を使用して実行されました。グリコシド結合の周りの立体構造の変化によって課せられる空間的制約は、失速の部分的に原因である可能性があると判断されましたが、結果は観察されたより高い失速収量の一部を完全に説明していません。8-オキソグと結合部位内の残基間の誘導H結合相互作用とともに変化したπ-πスタッキングも、XRN-1効率の低下に役割を果たす可能性があると仮定します。全体として、これらの観察結果は、まだ発見/確立されていない他の要因が、酸化RNAの崩壊に寄与する可能性が高いことを示唆しています。さらに、XRN-1はM1Gを含むRNAを分解し、M6,6Aまたは8-BRGに遭遇した部位で軽度に失速しました。

Understanding how oxidatively damaged RNA is handled intracellularly is of relevance due to the link between oxidized RNA and the progression/development of some diseases as well as aging. Among the ribonucleases responsible for the decay of modified (chemically or naturally) RNA is the exonuclease Xrn-1, a processive enzyme that catalyzes the hydrolysis of 5'-phosphorylated RNA in a 5'→3' direction. We set out to explore the reactivity of this exonuclease towards oligonucleotides (ONs, 20-nt to 30-nt long) of RNA containing 8-oxo-7,8-dihydroguanosine (8-oxoG), obtained via solid-phase synthesis. The results show that Xrn-1 stalled at sites containing 8-oxoG, evidenced by the presence of a slower moving band (via electrophoretic analyses) than that observed for the canonical analogue. The observed fragment(s) were characterized via PAGE and MALDI-TOF to confirm that the oligonucleotide fragment(s) contained a 5'-phosphorylated 8-oxoG. Furthermore, the yields for this stalling varied from app. 5-30% with 8-oxoG located at different positions and in different sequences. To gain a better understanding of the decreased nuclease efficiency, we probed: 1) H-bonding and spatial constraints; 2) anti-syn conformational changes; 3) concentration of divalent cation; and 4) secondary structure. This was carried out by introducing methylated or brominated purines (m1G, m6,6A, or 8-BrG), probing varying [Mg2+], and using circular dichroism (CD) to explore the formation of structured RNA. It was determined that spatial constraints imposed by conformational changes around the glycosidic bond may be partially responsible for stalling, however, the results do not fully explain some of the observed higher stalling yields. We hypothesize that altered π-π stacking along with induced H-bonding interactions between 8-oxoG and residues within the binding site may also play a role in the decreased Xrn-1 efficiency. Overall, these observations suggest that other factors, yet to be discovered/established, are likely to contribute to the decay of oxidized RNA. In addition, Xrn-1 degraded RNA containing m1G, and stalled mildly at sites where it encountered m6,6A, or 8-BrG, which is of particular interest given that the former two are naturally occurring modifications.