結合したポリエチレングリコール鎖の長さと構造の効果流体力学的半径、およびクロマトグラフィーによるペグ化ヒト血清アルブミンの分離

目的：この研究では、結合したポリエチレングリコール（PEG）鎖の長さと構造が流体力学的半径（RH）とペギル化タンパク質のクロマトグラフィー保持に焦点を当てています。これを目指して、標準タンパク質としてヒト血清アルブミン（HSA）は、特にMPEG-マレイミドを使用してペグ化部位でした。方法：分離されたPEG_HSA画分は、サイズの除外およびアニオン交換クロマトグラフィ（AEXC）によって分析されました。画分の純度とペギル化および天然タンパク質の相対的な移動性は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）によって分析されました。流体力学的半径は、サイズ除外クロマトグラフィー（SEC）の画分の保持時間に基づいて決定され、以前に報告された方程式に応じて決定されました。結果：結合したPEGの分子量とPEGYLATED HSAのRHの間に線形関係が示されました。線形PEGと分岐PEGで修飾されたタンパク質のRH間に有意差は示されませんでした。SDS-PAGEでは、ペグ化タンパク質の動きに対する分岐PEGの遅延効果は、線形PEGの動きよりも高かった。結論：Pegylated HSAとDimer HSAはほぼ同じサイズであり、Secで非常に近い保持時間で溶出するため、この場合、イオン交換クロマトグラフィー（IEXC）は、ペギル化HSAの分離においてSECよりも効果的です。分岐したPEG-HSAは、線形PEG-HSAと比較して、アニオン交換クロマトグラフィーの以前の溶出を示し、これにより、付着したPEGのさまざまな構造のさまざまなシールド効果を説明できます。ネイティブHSAおよび付着PEGの流体力学的半径の合計と比較して、タンパク質の周囲のポリマーのシールド付き付着の結果として、ペグ化HSAのサイズが小さいことができます。

Purpose: This study focuses on the effect of length and structure of attached polyethylene glycol (PEG) chain on hydrodynamic radius (Rh ) and chromatographic retention of PEGylated protein. To this aim human serum albumin (HSA) as a standard protein was PEGylated site specifically with mPEG-maleimide. Methods: Separated PEG_HSA fractions were analyzed by size exclusion and anion exchange chromatography (AExC). The purity of fractions and the relative mobility of PEGylated and native proteins were analyzed by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Hydrodynamic radius was determined based on the retention time of fractions on size exclusion chromatography (SEC), and also according to the previously reported equations. Results: A linear relation was shown between the molecular weight of attached PEG and Rh of PEGylated HSA. No significant difference between Rh of proteins modified with linear and branched PEG was shown. In SDS-PAGE, the delaying effect of branched PEG on movement of PEGylated protein was higher than that of linear PEG. Conclusion: As PEGylated HSA and dimer HSA have almost the same size and in SEC they elute at very close retention times, so in this case ion exchange chromatography (IExC) is more effective than SEC in separation of PEGylated HSA. Branched PEG- HSA showed earlier elution on anion exchange chromatography compared to linear PEG-HSA, that this can explain the different shielding effect of various structures of attached PEGs. The smaller size of PEGylated HSA in compare to the sum of the hydrodynamic radiuses of native HSA and attached PEG could be as a result of shielded attachment of polymer around protein.