スライサー活動のために、イネからのアルゴノートスマルRNA複合体の迅速かつ特異的精製

Argonaute（Ago）タンパク質は、小さなRNA（SRNA）と関連してRNA誘導サイレンシング複合体（RISC）を形成します。AGOSのリボヌクレアーゼ（スライサー）活性は、特に植物において、RISCを介したRNAサイレンシングにとって重要なSRNA補体ターゲット切断に必要です。小さなRNAのシーケンスは、それらの表現と下流の効果を理解するための明らかな選択です。また、新規および多型miRNAを特定する機会を提供します。最近、in vivo miRNA誘導切断活性を再現できるin vitroで、米（Oryza sativa）Ago1aスライサーアッセイを正常に再構成しました。ここでは、OSAGO1A-SRNA複合体の精製およびさらなるスライサーアッセイ、小さなRNAシーケンス、およびバイオインフォマティック解析のための詳細なプロトコルを提供します。このプロトコルは、他の植物におけるAGO複合体の精製とその後の分析に容易に適合させることができます。

Argonaute (AGO) proteins associate with small RNAs (sRNAs) to form an RNA-induced silencing complex (RISC). The ribonuclease (slicer) activity of AGOs is required for the sRNA-complementary target cleavage, which is important for RISC-mediated RNA silencing, especially in plants. Sequencing small RNAs is an obvious choice to understand their expression and downstream effects. It also provides an opportunity to identify novel and polymorphic miRNAs. Recently, we have successfully reconstituted rice (Oryza sativa) AGO1a slicer assays in vitro that are able to recapitulate in vivo miRNA-guided cleavage activity. Here we provide a detailed protocol for the purification of OsAGO1a-sRNA complexes and further slicer assays, small RNA sequencing and bioinformatic analysis. This protocol can be readily adapted for the purification and subsequent analyses of the AGO complexes in other plants.