サンドイッチエリザの免疫化学 - 私は、プラスチックに吸着されたモノクローナルおよびポリクローナル捕捉抗体への免疫グロブリンの結合特性と、対称的および非対称抗体酵素コンジュゲートによる検出による検出

ラジオラベルを付けたウシIgG1、IgG2、SIGAおよびIgM、およびこれらのアイソタイプに対する重鎖特異的ポリクローナルおよびモノクローナル抗体は、サンドイッチ酵素イムノアッセイ（ELISAS）の免疫化学的側面を調査するためのモデルとして使用されました。酵素活性を測定することによって得られた滴定プロットは、放射性標識免疫グロブリンの固相捕捉抗体への結合が定量化されたときに得られたものと並行した。質量法から予測されたように、結合した標識免疫グロブリンの割合は、サンドイッチELISA滴定がログログプロットで線形である範囲で一定のままでした。また、質量法から予測されたように、親和性精製によるポリクローナル抗体の固相濃度を増加させると、ログログELISAプロットの線形領域と、一定の割合の免疫グロブリン結合が観察された対応する領域が増加しました。等しい濃度でプラスチックに吸着された捕捉抗体として使用すると、最高のモノクローナル抗体は、結合ヨウ素化ウシ免疫グロブリンにおけるポリクローナルの対応物と同じように1/16未満でした。これらの違いは、ポリクローナル試薬の8倍以上の機能的、相対的な親和性から生じるように直接解釈できます。立体障害は、対称的なサンドイッチELISA、すなわち捕捉抗体と検出抗体が重鎖特異的であり、IgM免疫グロブリンではなくモノマーを測定するために使用される場合に発生することが示されました。非対称構成、つまり抗ファブ抗体酵素コンジュゲートの使用は、この問題を回避します。アビジン - ビオチン系である西洋ワラディッシュペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼに基づく対称コンジュゲートは、非対称（抗ファブ）の対応物よりも効果が低かった。対称結合剤のより低い活性が、異なるサイズの西洋ワラディッシュのペルオキシダーゼ抗体コンジュゲートを使用して立体障害によるものであるという証拠が示されました。アフィニティ培養されたポリクローナル固相抗体と非対称のコンジュゲートを使用したサンドイッチアッセイは、免疫化学的および経済的に最適であると判断されました。非対称構成を使用すると、サンドイッチELISA滴定プロットの非線形性は、抗体制限システムの抗体と抗原比を変化させる予測可能な結果であり、検出システムの立体障害の結果ではありません。

Radiolabelled bovine IgG1, IgG2, SIgA and IgM and heavy-chain specific polyclonal and monoclonal antibodies to these isotypes were employed as models to investigate immunochemical aspects of sandwich enzyme immunoassays (ELISAs). The titration plots obtained by measuring enzyme activity paralleled those obtained when the binding of radiolabelled immunoglobulins to solid-phase capture antibodies was quantitated. As predicted from the Mass Law, the percentage of labelled immunoglobulin which was bound remained constant over the range in which the sandwich ELISA titration was linear on a log-log plot. Also as predicted from the Mass Law, increasing the solid-phase concn of polyclonal antibodies by affinity purification increased the linear region of the log-log ELISA plot and the corresponding region over which a constant percentage of immunoglobulin binding was observed. When used as capture antibodies adsorbed on plastic at equal concns, the best monoclonal antibodies were 1/8- less than 1/16 as effective as their polyclonal counterparts in binding iodinated bovine immunoglobulins; these differences can be directly interpreted to result from an 8 and greater than 16-fold higher functional, relative affinity of the polyclonal reagents. Steric hindrance was shown to occur when symmetrical sandwich ELISAs, i.e. capture and detection antibody are both heavy-chain specific, are used to measure monomeric but not IgM immunoglobulins. The use of an asymmetrical configuration, i.e. anti-Fab antibody-enzyme conjugates, avoids this problem. Symmetrical conjugates based on the avidin-biotin system, horseradish peroxidase or alkaline phosphatase, were less effective than their asymmetrical (anti-Fab) counterparts. Evidence that the lower activity of symmetrical conjugates was due to steric hindrance was illustrated using horseradish peroxidase-antibody conjugates of different sizes. Sandwich assays using affinity-purified, polyclonal solid-phase antibodies and an asymmetrical conjugate were judged to be immunochemically and economically optimal. Using an asymmetrical configuration, the non-linear nature of sandwich ELISA titration plots is the predictable result of changing antibody to antigen ratios in an antibody-limiting system, and not the result of steric hindrance of the detection system.