トリプティック酵素活性に影響を与えることなく、mAbのジスルフィドスクランブルを防ぐ単純な非還元ペプチドマッピング方法の開発

液体クロマトグラフィマス分析（LC-MS）分析による非還元ペプチドマッピングは、ジスルフィド結合特性評価のための一般的に使用される方法です。ただし、サンプル調製中に誘導されるジスルフィドスクランブルアーティファクトは、基本的なpHおよび高温が変性および消化中に使用される場合にしばしば観察されます。ジスルフィドスクランブルアーティファクトを最小限に抑えるために、さまざまな酸性pH条件を使用した方法が複数のグループによって開発されています。ただし、pH条件が低下し、非特異的切断が増加し、非特異的な切断が増加し、タンパク質の特性評価で使用される酵素の大部分がアルカリ性pHで最も効率的であるため、ジスルフィド結合分析を複雑にします。ここでは、酸化剤、シスタミン、および低濃度のヨードアセトアミド（IAA）アルキル化剤を追加することにより、基本的なpHでのジスルフィドスクランブルを最小限に抑えるMAB特性評価のための非還元ペプチドマッピング方法を開発しました。カッパライトチェーンを備えた2つのヒトIgG1 mAbと、ラムダ軽チェーンを備えたもう1つは、メソッドを開発および最適化するためのモデルタンパク質として使用されました。この新しい方法を使用して、軽鎖が多い鎖（LC-HC）に関連するジスルフィドスクランブルペプチドは、従来の方法と比較して再現性が高く、糖分間破壊が大幅に減少しました。結果は、サンプル調製中に生成されたシスタミンアドレス法が堅牢であり、ジスルフィドスクランブルアーティファクトを最小限に抑えることを実証しました。

Non-reduced peptide mapping by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) analysis is a commonly used method for disulfide linkage characterization to assess structural integrity and quality of therapeutic monoclonal antibodies (mAbs). However, disulfide scrambling artifacts induced during sample preparation are often observed when basic pH and high temperatures are used during denaturation and digestion. To minimize disulfide scrambling artifacts, methods using various acidic pH conditions have been developed by multiple groups. However, lower pH conditions increase missed and non-specific cleavages, which complicates disulfide bond analysis because the majority of enzymes used in protein characterization are most efficient at alkaline pH. Here, we developed a non-reduced peptide mapping method for mAb characterization that minimizes disulfide scrambling at basic pH by adding an oxidizing agent, cystamine, and a low concentration of iodoacetamide (IAA) alkylating agent. Two human IgG1 mAbs, one with kappa light chain and another one with lambda light chain, were used as model proteins to develop and optimize the method. Using this novel method, disulfide scrambled peptides related to light chain-heavy chain (LC-HC) inter-disulfide disruption were significantly reduced with high reproducibility compared to conventional methods. Results demonstrated that the cystamine-added method is robust and minimizes disulfide scrambling artifacts produced during sample preparation.