[D-アルロース3-エピメラーゼによる組換え菌の構造と固定化]

D-アルロース-3-エピメラーゼ（DPEASE）は、D-フルクトースのD-アルロースへの異性化の重要な酵素です。その熱安定性を改善するために、短い両親媒性ペプチド（SAP）をDPeaseのN末端に融合しました。SDS-PAGE分析により、異種発現DPEASEが亜種で正しく折りたたまれ、タンパク質サイズが33 kDaであることが示されました。40°Cで48時間インキュベートした後、SAP1-DSDpeaseの残留酵素活性は58％でした。組換えB.亜ティリス株を再利用可能にするために、細胞をアルギン酸ナトリウム（SA）および二酸化チタン（TiO2）の複合キャリアで固定しました。結果は、2％SA、2％CACL2、0.03％グルタルアルデヒド溶液、および1：4のTiO2の比率が固定化に最適であることを示しました。これらの条件下では、固定化された細胞の活性の最大82％が保持される可能性があります。遊離細胞と比較して、固定化された細胞の最適な反応温度は80°Cで変化しませんでしたが、熱安定性は改善されました。10回連続のサイクルの後、機械的強度は変化しませんでしたが、酵素活性の58％が保持される可能性があり、28.8％の変換率が達成されました。この研究は、SAPSを使用して組換え酵素の熱安定性を改善するための簡単なアプローチを実証しました。さらに、固定化中にSAにTiO2を添加することが、機械的強度を高め、細胞の漏れを減らすことが実証されました。

D-allulose-3-epimerase (DPEase) is the key enzyme for isomerization of D-fructose to D-allulose. In order to improve its thermal stability, short amphiphilic peptides (SAP) were fused to the N-terminal of DPEase. SDS-PAGE analysis showed that the heterologously expressed DPEase folded correctly in Bacillus subtilis, and the protein size was 33 kDa. After incubation at 40 °C for 48 h, the residual enzyme activity of SAP1-DSDPEase was 58%. To make the recombinant B. subtilis strain reusable, cells were immobilized with a composite carrier of sodium alginate (SA) and titanium dioxide (TiO2). The results showed that 2% SA, 2% CaCl2, 0.03% glutaraldehyde solution and a ratio of TiO2 to SA of 1:4 were optimal for immobilization. Under these conditions, up to 82% of the activity of immobilized cells could be retained. Compared with free cells, the optimal reaction temperature of immobilized cells remained unchanged at 80 °C but the thermal stability improved. After 10 consecutive cycles, the mechanical strength remained unchanged, while 58% of the enzyme activity could be retained, with a conversion rate of 28.8% achieved. This study demonstrated a simple approach for using SAPs to improve the thermal stability of recombinant enzymes. Moreover, addition of TiO2 into SA during immobilization was demonstrated to increase the mechanical strength and reduce cell leakage.