マウスの糞便中の宿主と細菌タンパク質の識別のためのプロテオミクスサンプル調製の準備

ボトムアッププロテオミクスは、マウス腸内微生物叢の機能的特性評価のための強力な方法です。現在まで、マウスの腸のボトムアッププロテオミクス研究のほとんどは、限られた量の糞便サンプルに依存しています。質量制限サンプルでは、このような分析の性能は、タンパク質抽出プロトコルと汚染物質除去戦略に大きく依存しています。ここでは、タンパク質抽出プロトコル（異なる溶解バッファーを使用）と汚染物質除去戦略（さまざまな種類のフィルターとビーズを使用）を体系的に評価して、定量的再現性と特定されたタンパク質の数を最大化しました。全体として、我々の結果は、TRIS-HCLのドデシル硫酸ナトリウム（SDS）と尿素の組み合わせを使用して、タンパク質HClの尿素を使用してタンパク質抽出法を推奨しています。これらの条件は、困難な作業であるしっかりしたタンパク質やアクチノバクテリアなどのグラム陽性菌から特定されたタンパク質の数の増加につながりました。私たちの分析により、これらの条件により、プロテオバクテリアなどの豊富な細菌門が抽出されたことがさらに確認されました。さらに、最適化された抽出方法と結合した場合、サスペンショントラップ（S-TRAP）は、最も再現可能な方法を提供しながら最大数のタンパク質同定を生成することにより、他の汚染物質除去方法よりも優れていることがわかりました。全体として、最適化されたサンプル準備ワークフローは簡単かつ高速であり、最小限のサンプル処理が必要です。さらに、私たちのアプローチでは、大量の糞便サンプルは必要ありません。これは、特定の生理学的状態のためにマウスがより少量の糞便を産生するプロテオミクス研究で重要な考慮事項です。最終的な方法では、マウスの糞便材料の効率的な消化を提供し、再現性があり、宿主タンパク質と微生物叢タンパク質の両方に高いプロテオーム被覆をもたらします。

Bottom-up proteomics is a powerful method for the functional characterization of mouse gut microbiota. To date, most of the bottom-up proteomics studies of the mouse gut rely on limited amounts of fecal samples. With mass-limited samples, the performance of such analyses is highly dependent on the protein extraction protocols and contaminant removal strategies. Here, protein extraction protocols (using different lysis buffers) and contaminant removal strategies (using different types of filters and beads) were systematically evaluated to maximize quantitative reproducibility and the number of identified proteins. Overall, our results recommend a protein extraction method using a combination of sodium dodecyl sulfate (SDS) and urea in Tris-HCl to yield the greatest number of protein identifications. These conditions led to an increase in the number of proteins identified from gram-positive bacteria, such as Firmicutes and Actinobacteria, which is a challenging task. Our analysis further confirmed these conditions led to the extraction of non-abundant bacterial phyla such as Proteobacteria. In addition, we found that, when coupled to our optimized extraction method, suspension trap (S-Trap) outperforms other contaminant removal methods by providing the most reproducible method while producing the greatest number of protein identifications. Overall, our optimized sample preparation workflow is straightforward and fast, and requires minimal sample handling. Furthermore, our approach does not require high amounts of fecal samples, a vital consideration in proteomics studies where mice produce smaller amounts of feces due to a particular physiological condition. Our final method provides efficient digestion of mouse fecal material, is reproducible, and leads to high proteomic coverage for both host and microbiome proteins.