ラパマイシン誘発FKBP-FRB相互作用とオートファジーに対するFKBP12由来の細胞内ペプチドの効果

プロテアソームによって生成された細胞内ペプチド（Inpeps）は、以前にタンパク質間相互作用の推定天然調節因子（PPI）として示唆されていました。ここでの主な目的は、PPIに対する細胞内ペプチドVFDVell（VFD7）および関連ペプチドの細胞内効果を調査することでした。ペプチドの内在化は、C末端を共有結合した細胞透過ペプチド（CPP; ygrkkrrqrrrr）を使用して達成されました。PPIの可能性のある阻害は、Nanobit®ルシフェラーゼ構造補完レポーターシステムを使用して調査されました。それぞれのプラスミドベクターが同時に、FK506結合タンパク質（FKBP）またはFKBP結合ドメイン（FRB）のfkbp結合ドメイン（FRB）のいずれかを同時にエンコードします。1（mtorc1）。細胞内のFKBP-FRBとの相互作用は、ラパマイシン誘導下で発生します。結果は、ヒト胚腎293（HEK293）細胞内のFKBP-FRB間のラパマイシン誘発相互作用が、VFD7-CPP（10-500 nm）およびFdvellygrkkrrqrrr（vfd6-cpp; 1-500 nm）によって阻害されることを示しました。追加のVFD7-CPP誘導体は、ラパマイシンによって誘導されるFKBP-FRB相互作用を阻害するのに少ないか、効果的ではなかった。Molecular Dynamicsシミュレーションは、VFD7-CPP、VFD6-CPP、VFAVELLYGRKKKRRQRRR（VFA7-CPP）、VFEVELLYGRKKKKRRQRRR（VFA7-CPP）などの選択されたペプチドがFKBPに縛られ、FRBタンパクズレースに結合することを示唆しています。ただし、VFD7-CPPとVFD6-CPPのみがFKBP構造の変化を誘発したため、PPI阻害のメカニズムを理解するのに役立ちます。HEK293細胞から抽出されたInpepsは、主に高分子成分（すなわち、タンパク質および/または核酸）に関連していることがわかり、Inpepsの細胞内タンパク質分解安定性と細胞内の作用阻害メカニズムの理解に寄与しました。低酸素レオキシゲン化によって誘導される細胞死のモデルでは、VFD6-CPP（1 µM）は、MTORC1調節オートファジー関連の遺伝子5（ATG5）を発現するマウス胚性線維芽細胞（MEF）の生存率を増加させましたが、オートファジーデビルではありませんでしたATG5の発現を欠く細胞。これらのデータは、VFD6-CPPがラパマイシンの長期治療の望ましくない副作用を減らす治療用途を持つ可能性があることを示唆しています。要約すると、本報告書は、Inpepsが生物学的意義を持ち、細胞内PPIを標的とする治療分子の合理的な設計のための貴重なツールになる可能性があるというさらなる証拠を提供します。

Intracellular peptides (InPeps) generated by proteasomes were previously suggested as putative natural regulators of protein-protein interactions (PPI). Here, the main aim was to investigate the intracellular effects of intracellular peptide VFDVELL (VFD7) and related peptides on PPI. The internalization of the peptides was achieved using a C-terminus covalently bound cell-penetrating peptide (cpp; YGRKKRRQRRR). The possible inhibition of PPI was investigated using a NanoBiT® luciferase structural complementation reporter system, with a pair of plasmids vectors each encoding, simultaneously, either FK506-binding protein (FKBP) or FKBP-binding domain (FRB) of mechanistic target of rapamycin complex 1 (mTORC1). The interaction of FKBP-FRB within cells occurs under rapamycin induction. Results shown that rapamycin-induced interaction between FKBP-FRB within human embryonic kidney 293 (HEK293) cells was inhibited by VFD7-cpp (10-500 nM) and FDVELLYGRKKRRQRRR (VFD6-cpp; 1-500 nM); additional VFD7-cpp derivatives were either less or not effective in inhibiting FKBP-FRB interaction induced by rapamycin. Molecular dynamics simulations suggested that selected peptides, such as VFD7-cpp, VFD6-cpp, VFAVELLYGRKKKRRQRRR (VFA7-cpp), and VFEVELLYGRKKKRRQRRR (VFA7-cpp), bind to FKBP and to FRB protein surfaces. However, only VFD7-cpp and VFD6-cpp induced changes on FKBP structure, which could help with understanding their mechanism of PPI inhibition. InPeps extracted from HEK293 cells were found mainly associated with macromolecular components (i.e., proteins and/or nucleic acids), contributing to understanding InPeps' intracellular proteolytic stability and mechanism of action-inhibiting PPI within cells. In a model of cell death induced by hypoxia-reoxygenation, VFD6-cpp (1 µM) increased the viability of mouse embryonic fibroblasts cells (MEF) expressing mTORC1-regulated autophagy-related gene 5 (Atg5), but not in autophagy-deficient MEF cells lacking the expression of Atg5. These data suggest that VFD6-cpp could have therapeutic applications reducing undesired side effects of rapamycin long-term treatments. In summary, the present report provides further evidence that InPeps have biological significance and could be valuable tools for the rational design of therapeutic molecules targeting intracellular PPI.