植物細胞のオーキシンダイナミクスの定量分析のための遺伝的にエンコードされたバイオセンサー

固着生物としての植物は、複雑で絡み合ったシグナル伝達ネットワークを持ち、反応し、異なる内部および外部刺激に向けて行動を適応させます。この高いレベルの複雑さにより、Plantaでの定量的分子ツールの実装は依然として困難です。増え続ける学際的な分野としての合成生物学は、ライフサイエンスに基本的な工学原則を適用します。細菌や哺乳類細胞などのさまざまな生物で、合成スイッチ、回路、さらにはさらに高次のネットワークが多数実装されており、シグナル伝達および代謝経路の研究を促進しています。ただし、植物でのそのようなツールの適用は遅れているため、植物シグナル伝達の定量的調査に向けて、遺伝的にエンコードされたバイオセンサーとスイッチは少数のみです。ここでは、シロイヌナズナのプロトプラストにおけるオーキシンシグナル伝達の定量分析のためのプロトコルを提示します。遺伝的にエンコードされた、レシオメトリック、劣化ベースの発光バイオセンサーを実装し、オーキシン知覚ダイナミクスを研究するためにそれらを適用しました。このために、センサーモジュールとして3つの異なるAUX/IAASを使用し、オーキシンに応じて分解挙動を分析しました。私たちの実験的アプローチには、単純なハードウェアと実験試薬が必要であるため、すべての植物関連または細胞培養研究所に実装できます。このシステムにより、さまざまなレベルでのオーキシン認識とシグナル伝達の側面の分析が可能になり、たとえばストリゴラクトンのように、他のホルモンに簡単に拡張できます。さらに、モジュラーセンサー設計により、簡単な時間節約アプローチでセンサーモジュールを実装できます。

Plants, as sessile organisms, possess complex and intertwined signaling networks to react and adapt their behavior toward different internal and external stimuli. Due to this high level of complexity, the implementation of quantitative molecular tools in planta remains challenging. Synthetic biology as an ever-growing interdisciplinary field applies basic engineering principles in life sciences. A plethora of synthetic switches, circuits, and even higher order networks has been implemented in different organisms, such as bacteria and mammalian cells, and facilitates the study of signaling and metabolic pathways. However, the application of such tools in plants lags behind, and thus only a few genetically encoded biosensors and switches have been engineered toward the quantitative investigation of plant signaling. Here, we present a protocol for the quantitative analysis of auxin signaling in Arabidopsis thaliana protoplasts. We implemented genetically encoded, ratiometric, degradation-based luminescent biosensors and applied them for studying auxin perception dynamics. For this, we utilized three different Aux/IAAs as sensor modules and analyzed their degradation behavior in response to auxin. Our experimental approach requires simple hardware and experimental reagents and can thus be implemented in every plant-related or cell culture laboratory. The system allows for the analysis of auxin perception and signaling aspects on various levels and can be easily expanded to other hormones, as for example strigolactones. In addition, the modular sensor design enables the implementation of sensor modules in a straightforward and time-saving approach.