大きなフィールド深さの回転点スプレッド関数による3次元拡散係数測定

単一分子局在顕微鏡検査における顕著な課題は、3次元（3D）サンプルで移動するナノオブジェクトのリアルタイム、高速、正確な局在です。3D単一分子局在のための確立された方法は、ダブルヘリックスのポイントスプレッド機能（DH-PSF）エンジニアリングであり、追加の光学要素を使用してPSFに異なるナノ粒子の深さを持つ異なる回転角度を示すようにします。ただし、コンパクトなメインローブのサイズ、効果的な検出深さ、回転角と深さの間の正確な変換が必要であり、DH-PSF生成法に課題をもたらします。ここでは、フレネルゾーンベースのスパイラルフェーズを使用して、よりコンパクトなDH-PSFを生成し、純粋な位相マスクは高い透過効率を達成します。最終生成されたDH-PSFは、各軸方向の位置で線形回転速度を持ち、より正確な回転角と深度変換を示します。Cramer-Raoの下限計算結果は、DH-PSFの軸方向の深さが〜11µmに伸びていることを示しています。3000光子で〜45Nmの軸局在精度と15の平均バックグラウンドノイズ。測定された結果は、理論値から6％の誤差以内であり、ナノ粒子拡散係数測定のDH-PSFの優れた性能を示しています。

A prominent challenge in single-molecule localization microscopy is the real-time, fast, and accurate localization of nano-objects moving in three-dimensional (3D) samples. A well-established method for 3D single-molecule localization is the double-helix pointspread-function (DH-PSF) engineering, which uses additional optical elements to make the PSF exhibit different rotation angles with different nanoparticle depths. However, the compact main lobe size, effective detection depth, and precise conversion between rotation angle and depth are necessary, posing challenges to the DH-PSF generation method. Here we generate a more compact DH-PSF using Fresnel-zone-based spiral phases, and the pure phase mask achieves high transmission efficiency. The final generated DH-PSFs have a linear rotation rate at each axial position, showing a more accurate rotation angle and depth conversion. The Cramer-Rao lower limit calculation results show that the axial depth of DH-PSF extends to ∼11µm with an axial localization precision of ∼45nm at 3000 photons and average background noise of 15. We measured the diffusion coefficient of nanospheres in different concentrations of glycerol using the generated DH-PSF. The measured results are within 6% error from the theoretical values, indicating the superior performance of the DH-PSF for nanoparticle diffusion coefficient measurements.