薬物代謝酵素の発現のためのバキュロウイルス哺乳類細胞発現システムの使用：シトクロムP450 3A4に焦点を当てた感染の最適化

異種発現系は、薬物代謝酵素の機能に対する一塩基多型などの遺伝的要因の影響を分析するために重要です。この研究では、この目的のためのより安全で効率的なアプローチとして、バキュロウイルス哺乳動物細胞（Bac-Mam）発現システムに焦点を当てました。バキュロウイルス昆虫細胞発現系は、大規模なタンパク質発現に広く利用されています。バキュロウイルスは昆虫細胞内でのみ複製しますが、特定の哺乳類細胞にも感染することが示されています。この知識に基づいて、バキュロウイルスは現在、Bac-Mamシステムと呼ばれる哺乳動物発現システムに応用されており、プロモーターが哺乳動物細胞で機能できるものに置き換えられた遺伝子改変バキュロウイルスが使用される。シトクロム P450 3A4 (CYP3A4)、UDP グルクロノシルトランスフェラーゼ (UGT) 1A1、UGT2B7 のオープン リーディング フレームを Bac-Mam システム用のトランスファー プラスミドにサブクローニングし、組換え Bac-Mam ウイルスを調製しました。得られたウイルスを昆虫の Sf9 細胞で増幅し、哺乳類の COS-1 細胞に感染させるために使用しました。COS-1 細胞ホモジェネートにおける CYP3A4、UGT1A1、および UGT2B7 の発現はイムノブロッティングによって確認されました。Bac-Mam ウイルスの量、収集前の培養日数、ウイルス形質導入のエンハンサーである酪酸ナトリウムの濃度を含む最適な感染条件は、CYP3A4 発現をモニタリングすることによって決定されました。発現されたCYP3A4は、ヘミン/5-アミノレブリン酸の供給やNADPH-チトクロームP450レダクターゼとの共発現なしに適切な活性を示しました。さらに、Bac-Mam システムと、組換えプラスミドとトランスフェクション試薬を使用する確立された方法との間で遺伝子導入効率を比較しました。私たちの結果は、Bac-Mam システムが薬物代謝研究で広く使用されている哺乳動物細胞への薬物代謝酵素遺伝子の導入に適用できることを示しています。発現された酵素は、哺乳動物の体内と同様に、適切な翻訳後修飾を受けることが予想されます。したがって、Bac-Mam システムは薬理遺伝学および薬理ゲノミクス研究を加速する可能性があります。

Heterologous expression systems are important for analyzing the effects of genetic factors including single nucleotide polymorphisms on the functions of drug-metabolizing enzymes. In this study, we focused on a baculovirus-mammalian cell (Bac-Mam) expression system as a safer and more efficient approach for this purpose. The baculovirus-insect cell expression system is widely utilized in large-scale protein expression. Baculovirus has been shown to also infect certain mammalian cells, although the virus only replicates in insect cells. With this knowledge, baculovirus is now being applied in a mammalian expression system called the Bac-Mam system wherein a gene-modified baculovirus is used whose promotor is replaced with one that can function in mammalian cells. We subcloned open-reading frames of cytochrome P450 3A4 (CYP3A4), UDP-glucuronosyltransferase (UGT) 1A1, and UGT2B7 into a transfer plasmid for the Bac-Mam system, and prepared recombinant Bac-Mam virus. The obtained virus was amplified in insect Sf9 cells and used to infect mammalian COS-1 cells. Expression of CYP3A4, UGT1A1, and UGT2B7 in COS-1 cell homogenates were confirmed by immunoblotting. Optimum infection conditions including the amount of Bac-Mam virus, culture days before collection, and concentration of sodium butyrate, an enhancer of viral-transduction were determined by monitoring CYP3A4 expression. Expressed CYP3A4 showed appropriate activity without supplying hemin/5-aminolevulinic acid or co-expressing with NADPH-cytochrome P450 reductase. Further, we compared gene transfer efficiency between the Bac-Mam system and an established method using recombinant plasmid and transfection reagent. Our results indicate that the Bac-Mam system can be applied to introduce drug-metabolizing enzyme genes into mammalian cells that are widely used in drug metabolism research. The expressed enzymes are expected to undergo appropriate post-translational modification as they are in mammalian bodies. The Bac-Mam system may thus accelerate pharmacogenetics and pharmacogenomics research.