ドーピングコントロールのための四重極軌道LC-MS/MSによるヒト尿中のヒゲナミン代謝産物の識別と特性評価

ヒゲナミンは、アコナイト、アノナスクアモサ、ナンツフ（神聖な竹）、および他の植物に見られるアルカロイドです。咳、喘息、心不全、勃起不全の治療に使用し、減量を支援することができます。また、世界のアンチドーピング機関（WADA）によって定義されているように、競争の内外で禁止された物質です。この作業では、ヒゲナミン代謝プロファイルを詳細に調査しました。2人の健康なボランティア（1人の男性と1人の女性）がヒゲナミン錠剤（5 mg）を服用し、尿サンプルを2週間採取しました。酵素加水分解を伴わない固相抽出（SPE）を使用して尿サンプルをきれいにし、尿抽出物を正確な質量測定で液体クロマトグラフィーカドルポール - オルビトラップ質量分析（Quadrupole-Orbitrap LC-MS/MS）によって分析しました。ヒゲナミンと32の代謝産物が検出されました：6匹のメチル化、10匹の硫酸化、16個のグルクロン酸化代謝産物。化学構造は断片化パターンによって解明され、これらの新たに報告された代謝物について正確な分子式の決定が得られました。メチル化、グルクロン酸化、硫酸化、およびこれらの組み合わせを含む3つの代謝経路は、主な代謝経路としてメチル化を提供しました。32のすべての代謝産物の尿中の投与後の検出窓を親薬物のそれと比較し、ヒゲナミンの誤用については新しい潜在的なバイオマーカー（M7）が提案されました。すべての尿サンプルは、2つのサンプル調製方法の2つのサンプル調製方法によって処理されました：希釈整理（DS）手順とSPEがそれに続く酸加水分解、および2つの方法のヒゲナミン陽性トレイルの期間を比較しました。DSメソッドは、和田が認定された研究所のほとんどでアスリートの尿サンプルを処理して遊離のヒゲナミンのみを検出するために使用されましたが、酸加水分解とそれに続くSPEが望ましいものであり、偽陰性の結果を回避するための日常的な分析を提供します。

Higenamine is an alkaloid found in aconite, Annona squamosa, nanzhu (sacred bamboo), and other plants. It can be used to treat coughing, asthma, heart failure, and erectile dysfunction as well as aid in weight loss. It is also a banned substance in and out of competition as defined by the World Anti-Doping Agency (WADA). In this work, higenamine metabolic profiles were investigated in detail. Two healthy volunteers (one male and one female) took a higenamine tablet (5 mg), and urine samples were collected for two weeks. Solid-phase extraction (SPE) without enzymatic hydrolysis was used to clean the urine samples, and the urine extracts were then analyzed by liquid chromatography-quadrupole-orbitrap mass spectrometry (quadrupole-orbitrap LC-MS/MS) with accurate mass measurements. Higenamine and 32 metabolites were detected: 6 methylated, 10 sulfated and 16 glucuronidated metabolites. The chemical structures were elucidated by their fragmentation patterns, and accurate molecular formula determination was obtained for these newly reported metabolites. Three metabolic pathways containing methylation, glucuronidation, sulfation, and combinations of these were provided with methylation as the main metabolic pathway. The post-dose detection windows within urine of all 32 metabolites were compared with that of the parent drug, and a new potential biomarker (M7) was suggested for higenamine misuse. All urine samples were processed by two sample preparation methods: the dilute-and-shoot (DS) procedure and acid hydrolysis followed by SPE, and the time periods for a higenamine positive trails of two methods were compared. Although the DS method used to process the urine samples of athletes in the most of WADA-accredited laboratories to detect only free higenamine, acid hydrolysis followed by SPE is preferable and offers routine analysis to avoid false-negative results.