白血球サブセットのフローサイトメトリー解析の改善：2色免疫蛍光法を用いた5つの細胞サブセットの同時同定

ヒト末梢血白血球のフローサイトメトリック分析は、通常、同じサンプルの複数のアリコートを、目的の細胞サブセットに特異的な蛍光試薬を染色することにより達成されました。複数のサブセット（TおよびB細胞など）または単一の試薬（活性化されたT細胞など）によって一意に識別されないサブセットの識別には、アリコートあたりの複数の試薬の使用が必要なアプリケーションのために、スペクトル離散フルオロクロームタグが開発されました。アリコートごとに2つ以上の試薬へのこのアプローチを拡張すると、デュアルレーザー励起と複雑な計装が必要なマルチカラー法につながりました。単一の励起源のみを使用して、5つの離散免疫細胞サブセットの同時識別を可能にする市販の試薬を使用した代替の2色法について説明します。この技術は、競合する非標識試薬を備えた市販の蛍光標識試薬の希釈を使用して、同じフルオロ色素を持つ試薬で染色すると重複または断続的に区別できないプロファイルを示す細胞サブセットの個別の蛍光強度プロファイルを選択的に生成します。たとえば、フィコエリトリン標識ヘルパーT（TH）細胞の蛍光強度は、フィコエリトリン標識抑制T（TS）細胞のそれとは異なるように調整できます。この手法を2色に拡張すると、7つの異なるモノクローナル抗体の組み合わせを使用して、単一のアリコートでTH、TS、B細胞、天然キラー細胞、および単球を同時に定量化しました。このアプローチの追加の利点は、「ヌル」セルをより正確に定量化する機能です。この方法によるさまざまな細胞サブセットの蛍光強度プロファイルの調整は、さまざまな細胞タイプのフローサイトメトリック分析に適用できます。この手法は、必要な計装の複雑さを大幅に増加させることなく、フローサイトメトリーの分析能力を大幅に拡張します。

Flow cytometric analysis of human peripheral blood leukocytes has typically been achieved by staining multiple aliquots of the same sample with fluorescent reagents specific for cell subsets of interest. Spectrally discrete fluorochrome tags have been developed for applications in which identification of multiple subsets (e.g., T and B cells) or of subsets not uniquely identified by a single reagent (e.g., activated T cells) requires use of multiple reagents per aliquot. Extension of this approach to more than two reagents per aliquot has led to multicolor methods requiring dual laser excitation and complex instrumentation. We describe an alternative two-color method using commercially available reagents that allows simultaneous identification of five discrete immune cell subsets using only a single excitation source. The technique uses dilution of commercial fluorochrome-labeled reagents with competing unlabeled reagents to selectively produce discrete fluorescence intensity profiles for cell subsets that would otherwise display overlapping or indistinguishable profiles when stained with reagents bearing the same fluorochrome. For example, the fluorescence intensity of phycoerythrin-labeled helper T (Th) cells can be adjusted to be distinct from that of phycoerythrin-labeled suppressor T (Ts) cells. Extending this technique to two colors, we have used a combination of seven different monoclonal antibodies to simultaneously quantify Th, Ts, B cells, natural killer cells, and monocytes in a single aliquot. An additional advantage of this approach is the ability to more accurately quantify "null" cells. Adjustment of fluorescence intensity profiles of different cell subsets by this method is applicable to flow cytometric analysis of a wide variety of cell types. The technique significantly extends the analytical capacity of flow cytometry without significantly increasing the complexity of the instrumentation required.