バクテリオファージT7 RNAポリメラーゼを使用して、クローン遺伝子の選択的高レベル発現を導きます

バクテリオファージT7 RNAポリメラーゼに基づく遺伝子発現システムが開発されました。T7 RNAポリメラーゼは、大腸菌では自然に発生しない独自のプロモーターに対して非常に選択的です。T7遺伝子1のクローンコピーから提供された比較的少量のT7 RNAポリメラーゼは、マルチコピープラスミドのT7プロモーターから高レベルの転写を誘導するのに十分です。このような転写は、プラスミドの周りで終了せずに数回進行する可能性があり、非常に活性が高いため、大腸菌RNAポリメラーゼによる転写が大幅に減少します。RNase IIIの切断部位が導入されると、プラスミドの長さの離散RNAが蓄積する可能性があります。T7 DNAからの天然転写ターミネーターも、プラスミドで効果的に機能します。合成速度とT7 RNAポリメラーゼが指示するRNAの蓄積の両方は、正常細胞のリボソームRNAのレベルに匹敵するレベルに達することができます。これらの高レベルの蓄積は、RNAが比較的安定していることを示唆しています。これは、おそらく3 '末端にある非常に長さおよび/または幹とループ構造がエクソヌクレリ溶解分解からそれらを保護するのに役立つためです。T7 RNAポリメラーゼによって産生される特定のmRNAは、大腸菌の翻訳機構を急速に飽和させる可能性が高いため、このようなmRNAからのタンパク質合成の速度は、主にその翻訳の効率に依存します。mRNAが効率的に翻訳されると、標的タンパク質は3時間以内に総細胞タンパク質の50％を超えるものに蓄積する可能性があります。アクティブなT7 RNAポリメラーゼを細胞に供給するために2つの方法を使用しました。遺伝子1を運ぶラムダ誘導体による感染、またはLacuv5プロモーターの制御下で遺伝子1の染色体コピーの誘導。遺伝子1が感染によって送達されると、非常に有毒な標的遺伝子は、高レベルで急速に発現するようになると、T7 RNAポリメラーゼが導入されるまで、細胞内で沈黙を維持できます。遺伝子1が染色体に存在する場合、誘導細胞に存在するT7 RNAポリメラーゼの非常に低い基底レベルでさえ、有毒標的遺伝子を運ぶプラスミドの確立を防ぐことができます。

A gene expression system based on bacteriophage T7 RNA polymerase has been developed. T7 RNA polymerase is highly selective for its own promoters, which do not occur naturally in Escherichia coli. A relatively small amount of T7 RNA polymerase provided from a cloned copy of T7 gene 1 is sufficient to direct high-level transcription from a T7 promoter in a multicopy plasmid. Such transcription can proceed several times around the plasmid without terminating, and can be so active that transcription by E. coli RNA polymerase is greatly decreased. When a cleavage site for RNase III is introduced, discrete RNAs of plasmid length can accumulate. The natural transcription terminator from T7 DNA also works effectively in the plasmid. Both the rate of synthesis and the accumulation of RNA directed by T7 RNA polymerase can reach levels comparable with those for ribosomal RNAs in a normal cell. These high levels of accumulation suggest that the RNAs are relatively stable, perhaps in part because their great length and/or stem-and-loop structures at their 3' ends help to protect them against exonucleolytic degradation. It seems likely that a specific mRNA produced by T7 RNA polymerase can rapidly saturate the translational machinery of E. coli, so that the rate of protein synthesis from such an mRNA will depend primarily on the efficiency of its translation. When the mRNA is efficiently translated, a target protein can accumulate to greater than 50% of the total cell protein in three hours or less. We have used two ways to deliver active T7 RNA polymerase to the cell; infection by a lambda derivative that carries gene 1, or induction of a chromosomal copy of gene 1 under control of the lacUV5 promoter. When gene 1 is delivered by infection, very toxic target genes can be maintained silent in the cell until T7 RNA polymerase is introduced, when they rapidly become expressed at high levels. When gene 1 is resident in the chromosome, even the very low basal levels of T7 RNA polymerase present in the uninduced cell can prevent the establishment of plasmids carrying toxic target genes, or make the plasmid unstable.(ABSTRACT TRUNCATED AT 400 WORDS)