spryおよびmb2cas12aを使用して、foki-dcasヌクレアーゼシステムのターゲティング範囲を拡大する

CRISPR-CAS9およびCAS12Aは、ゲノム編集のために広く使用されている配列固有のヌクレアーゼ（SSNS）です。CASタンパク質のヌクレアーゼドメインは、RNAガイド付きDNA標的にDNA二重鎖切断を誘導することができます。亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ZFN）および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALENS）は、CRISPRの前に人気のあるSSNSです。ZFNとタレンの両方は、2つのモノマーの再構成に基づいており、それぞれがDNA結合ドメインとFoki Nucleaseドメインで構成されています。ZFNとTalensの構成に触発されて、Dimeric Foki-DCAS9システムは以前にヒト細胞で実証されていました。ガイドRNA（GRNA）のペアに基づくこのような構成は、ターゲティングの特異性を大幅に改善します。二量体のFoki-DCASシステムのターゲティング範囲を拡張するために、PAM（プロトススペーサー隣接するモチーフ）-less Spry Cas9バリアントとPAMリラックスMB2CAS12Aシステムを調査しました。イネ細胞は、Foki-dspryがペアのSpry Nickaseシステムよりも堅牢な編集効率を持っていることを示しました。さらに、イネ細胞のMB2CAS12Aヌクレアーゼに同等の編集活動を示す二量体のFoki-DMB2CAS12Aシステムが開発されました。最後に、シングルチェーンのFoki-Foki-DMB2CAS12Aシステムが開発され、DNAがターゲティングシーケンスの外側にカットされました。これは、多くの汎用性の高いアプリケーションに役立ちます。一緒に、この作業は、ゲノム編集用のFokiベースのCRISPR-CASシステムを大幅に拡大しました。

CRISPR-Cas9 and Cas12a are widely used sequence-specific nucleases (SSNs) for genome editing. The nuclease domains of Cas proteins can induce DNA double strand breaks upon RNA guided DNA targeting. Zinc finger nucleases (ZFNs) and Transcription Activator-Like Effector Nucleases (TALENs) have been popular SSNs prior to CRISPR. Both ZFNs and TALENs are based on reconstitution of two monomers with each consisting of a DNA binding domain and a FokI nuclease domain. Inspired by the configuration of ZFNs and TALENs, dimeric FokI-dCas9 systems were previously demonstrated in human cells. Such configuration, based on a pair of guide RNAs (gRNAs), offers great improvement on targeting specificity. To expand the targeting scope of dimeric FokI-dCas systems, the PAM (protospacer adjacent motif)-less SpRY Cas9 variant and the PAM-relaxed Mb2Cas12a system were explored. Rice cells showed that FokI-dSpRY had more robust editing efficiency than a paired SpRY nickase system. Furthermore, a dimeric FokI-dMb2Cas12a system was developed that displayed comparable editing activity to Mb2Cas12a nuclease in rice cells. Finally, a single-chain FokI-FokI-dMb2Cas12a system was developed that cuts DNA outside its targeting sequence, which could be useful for many versatile applications. Together, this work greatly expanded the FokI based CRISPR-Cas systems for genome editing.