SLC35B2は、EV71感染に必要な宿主硫酸硫酸塩に二重の役割に作用します

重要な神経変動エンテロウイルスとして、エンテロウイルス71（EV71）は、乳児や幼児の重度の神経疾患と高い死亡率と時折関連することがあります。宿主因子とEV71の間の相互作用を理解することは、抗ウイルス剤の開発とワクチンの最適化において重要な役割を果たします。ここでは、ゲノム全体のCRISPR-CAS9ノックアウトスクリーンを実行し、スカベンジャー受容体クラスBメンバー2（SCARB2）、溶質キャリアファミリー35メンバーB2（SLC35B2）、およびベータ-1,3-グルクロニルトランスフェラーゼ3（B3GAT3）がEV71の複製を促進することに不可欠であることを明らかにしました。その後、分子メカニズムの調査により、SCARB2ではなくSLC35B2またはB3GAT3のノックアウトにより、EV71の細胞への結合が著しく減少し、細胞に内在化されることが示唆されました。さらに、EV71の感染効率は、単にヘパラン硫酸塩の量ではなく、宿主細胞硫酸塩のレベルと正の相関があることがわかりました。この考えを支持して、EV71のタンパク質受容体の中で硫酸化タンパク質をスクリーニングし、SCARB2がヒトのチロシルタンパク質スルホトランスフェラーゼの両方と一意に相互作用できることを確認しました。次に、Scarb2の質量分析を実行し、チロシン硫酸化の5つの部位を特定しました。関数検証テストは、SCARB2に5つ以上のチロシン硫酸部位があることを示しました。最後に、ヘパラン硫酸塩とSCARB2の両方がSLC35B2によって調節され、ウイルスの結合、内在化、および誘発をサポートするために協力的に作用するEV71エントリのモデルを構築しました。まとめると、プールされたCRISPR-CAS9遺伝子スクリーニングを実施して、宿主細胞とEV71の相互作用を調査したのはこれが初めてです。さらに、EV71侵入に重要な、ヘパラン硫酸塩硫酸塩とタンパク質チロシン硫酸化を含む全体的な硫酸化を調節する上で、新規宿主因子SLC35B2が二重の役割を果たしていることがわかりました。重要性の重要性は、特定の治療法を欠く最も重要な非ポリオ神経変動腸ウイルスであるため、EV71は中枢神経系に伝染し、乳児や幼児の重度および致命的な神経学的合併症につながる可能性があります。EV71複製を促進または阻害する新しい要因の特定は、ウイルス感染と病因のメカニズムを明らかにするために重要です。現在までに、EV71感染に関与する宿主因子のみが特徴付けられています。ここでは、HELA細胞でEV71を研究するために、初めてゲノム全体のCRISPR-CAS9機能ノックアウト（GECKO）スクリーンを実施しました。スクリーニング結果は、EV71複製を促進するポジティブ選択で518ヒットを含む候補者のランク付けリストとして提示され、細胞の成長と生存やEV71感染の抑制に不可欠なネガティブ選択で1,044ヒットが含まれます。その後、SCARB2、SLC35B2、およびB3GAT3のポジティブセレクションの上位3ヒットに集中しました。これら3つの遺伝子のいずれかのノックアウトは、EV71感染に対する強い耐性をもたらします。EV71感染が2つの受容体、ヘパラン硫酸塩とSCARB2に共依存していることを確認しました。また、宿主の侵入因子であるSLC35B2を特定し、宿主細胞硫酸の調節を通じてEV71感染を間接的に促進し、SCARB2に存在する新規翻訳後修飾、タンパク質チロシン硫酸化を決定しました。この研究は、EV71感染性がSLC35B2によって調節される細胞硫酸塩のレベルと有意な正の相関を示すことを明らかにしました。この研究でテストされたEV71および呼吸器合胞体ウイルス（RSV）を含むがこれらに限定されない多くの異なるウイルスに硫酸化経路が必要であるため、SLC35B2は広域スペクトル抗ウイルス療法の標的を表しています。

As an important neurotropic enterovirus, enterovirus 71 (EV71) is occasionally associated with severe neurological diseases and high mortality rates in infants and young children. Understanding the interaction between host factors and EV71 will play a vital role in developing antivirals and optimizing vaccines. Here, we performed a genome-wide CRISPR-Cas9 knockout screen and revealed that scavenger receptor class B member 2 (SCARB2), solute carrier family 35 member B2 (SLC35B2), and beta-1,3-glucuronyltransferase 3 (B3GAT3) are essential in facilitating EV71 replication. Subsequently, the exploration of molecular mechanisms suggested that the knockout of SLC35B2 or B3GAT3, not SCARB2, led to a remarkable decrease in the binding of EV71 to cells and internalization into cells. Furthermore, we found that the infection efficiency for EV71 was positively correlated with the level of host cell sulfation, not simply with the amount of heparan sulfate, suggesting that an unidentified sulfated protein(s) must contribute to EV71 infection. In support of this idea, we screened possible sulfated proteins among the proteinous receptors for EV71 and confirmed that SCARB2 could uniquely interact with both tyrosyl protein sulfotransferases in humans. We then performed mass spectrometric analysis of SCARB2, identifying five sites with tyrosine sulfation. The function verification test indicated that there were more than five tyrosine-sulfated sites on SCARB2. Finally, we constructed a model for EV71 entry in which both heparan sulfate and SCARB2 are regulated by SLC35B2 and act cooperatively to support viral binding, internalization, and uncoating. Taken together, this is the first time that we performed the pooled CRISPR-Cas9 genetic screening to investigate the interplay of host cells and EV71. Furthermore, we found that a novel host factor, SLC35B2, played a dual role in regulating the overall sulfation comprising heparan sulfate sulfation and protein tyrosine sulfation, which are critical for EV71 entry. IMPORTANCE As the most important nonpolio neurotropic enterovirus lacking specific treatments, EV71 can transmit to the central nervous system, leading to severe and fatal neurological complications in infants and young children. The identification of new factors that facilitate or inhibit EV71 replication is crucial to uncover the mechanisms of viral infection and pathogenesis. To date, only a few host factors involved in EV71 infection have been characterized. Herein, we conducted a genome-wide CRISPR-Cas9 functional knockout (GeCKO) screen for the first time to study EV71 in HeLa cells. The screening results are presented as a ranked list of candidates, including 518 hits in the positive selection that facilitate EV71 replication and 1,044 hits in the negative selection that may be essential for cell growth and survival or for suppressing EV71 infection. We subsequently concentrated on the top three hits in the positive selection: SCARB2, SLC35B2, and B3GAT3. The knockout of any of these three genes confers strong resistance against EV71 infection. We confirmed that EV71 infection is codependent on two receptors, heparan sulfate and SCARB2. We also identified a host entry factor, SLC35B2, indirectly facilitating EV71 infection through regulation of the host cell sulfation, and determined a novel posttranslational modification, protein tyrosine sulfation existing in SCARB2. This study revealed that EV71 infectivity exhibits a significant positive correlation with the level of cellular sulfation regulated by SLC35B2. Due to the sulfation pathway being required for many distinct viruses, including but not limited to EV71 and respiratory syncytial virus (RSV), which were tested in this study, SLC35B2 represents a target of broad-spectrum antiviral therapy.