リボソーム親和性浄化の翻訳の空間的および時間的感受性を高めるための分割緑色の蛍光タンパク質システム

翻訳リボソーム親和性浄化（TRAP）は、リボソームとそれらが翻訳しているmRNAのアフィニティ共精製のためにタグに融合したリボソームタンパク質を発現するトランスジェニック植物を利用します。積極的に翻訳されたmRNA（翻訳）のこの集団は、定量的PCRまたはRNAシーケンスによって尋問できます。条件または細胞固有のプロモーターを利用して、特定の細胞タイプの翻訳、さまざまな成長段階、および/または環境変数に応答して分離できます。微分発現を明らかにするために有利ですが、このアプローチは、条件/細胞特異的プロモーターの活性が弱い場合、リボソームの回転率が目的細胞で低い場合、または標的細胞が短命である場合、十分な感度を提供しない場合があります。これらの状況では、これらの特定のプロモーターの制御下でタグ付けされたリボソームを発現することは、下流分析のために十分なポリソームをもたらさない可能性があります。ここでは、2つのトランスゲンを使用する新しいトラップシステムについて説明します。1つは構成的に発現し、分割緑色蛍光タンパク質（GFP）の1つの断片に融合したリボソームタンパク質をコードします。2番目は刺激固有のプロモーターによって制御され、アフィニティ精製タグに融合した2番目のGFPフラグメントをエンコードします。両方のトランスジェンが活性な細胞では、精製タグは、双分子折りたたみと分割GFPフラグメントのアセンブリによりリボソームに取り付けられています。このアプローチは、既存のリボソームをラベル付けし、急速なリボソームの代謝回転に依存しないため、感度の向上とより良い時間分解能を提供します。このシステムの最適化と重要なパラメーターについて説明し、現在の技術では空間的および時間的解像度を達成することが困難な植物と病原体の相互作用に適用します。

Translating ribosome affinity purification (TRAP) utilizes transgenic plants expressing a ribosomal protein fused to a tag for affinity co-purification of ribosomes and the mRNAs that they are translating. This population of actively translated mRNAs (translatome) can be interrogated by quantitative PCR or RNA sequencing. Condition- or cell-specific promoters can be utilized to isolate the translatome of specific cell types, at different growth stages and/or in response to environmental variables. While advantageous for revealing differential expression, this approach may not provide sufficient sensitivity when activity of the condition/cell-specific promoter is weak, when ribosome turnover is low in the cells of interest, or when the targeted cells are ephemeral. In these situations, expressing tagged ribosomes under the control of these specific promoters may not yield sufficient polysomes for downstream analysis. Here, we describe a new TRAP system that employs two transgenes: One is constitutively expressed and encodes a ribosomal protein fused to one fragment of a split green fluorescent protein (GFP); the second is controlled by a stimulus-specific promoter and encodes the second GFP fragment fused to an affinity purification tag. In cells where both transgenes are active, the purification tag is attached to ribosomes by bi-molecular folding and assembly of the split GFP fragments. This approach provides increased sensitivity and better temporal resolution because it labels pre-existing ribosomes and does not depend on rapid ribosome turnover. We describe the optimization and key parameters of this system, and then apply it to a plant-pathogen interaction in which spatial and temporal resolution are difficult to achieve with current technologies.