[真核生物および原核生物のDNA-ポリメラーゼII酵素との結合におけるテンプレートのインターンヌクレオチドリン酸基の役割]

ヒト胎盤からのDNAポリメラーゼアルファのテンプレート結合部位に対する異なるリガンド（リン酸、ヌクレオシド一リン酸、オリゴヌクレオチド）の親和性が推定されました。この目標として、競合阻害剤としてのこれらのリガンドの濃度における、アフィニティ試薬D（PT）2PC [PT2+（NH3）2OH]（PT）7による酵素不活性化の速度の依存性が決定されました。DNAポリメラーゼアルファのテンプレート部位で結合できる最小リガンドは、トリエチルリン酸（KD 600 microM）およびリン酸（KD 53 microM）であることが示されました。リン酸塩からD（PT）までのモノマー単位を加えた因子1.71でリガンドの親和性が増加し、次にオリゴチミジル化D（TP）NT（N 1〜14）の場合に増加します。ホスホジエステル基の部分的なエチル化は、酵素とのオリゴチミジル酸結合の効率を変化させません。しかし、これらのグループの完全なエチル化は、オリゴチミジル酸塩の親和性を酵素に7〜9回低下させます。減少は、Mn2+ - イオンによって引き起こされる酵素に対するPT2+ - デカシミジル化親和性の変化に匹敵します。得られたデータは、酵素とホスホジエステル基の静電接触（おそらくME2+依存）が起こるという提案につながりました。接触のタイプは、ギブスのエネルギー変化1.1-1.4 kcal/moleによって確認されます。同じリン酸グループのp = Oグループの酸素原子との水素結合の形成も想定されています（Delta G = -4.4。。。-4.5 kcal/mole）。他のインターンクレオチドリン酸塩およびオリゴヌクレオチドのすべての塩基は、テンプレート結合部位との水素結合も静電接触も形成しません。テンプレートが1つのユニットによって延長されると、ギブスのエネルギーは0.32 kcal/モル増加します。この値は、酵素活性部位の妥協培地から疎水性環境へのオリゴヌクレオチドテンプレートの移行におけるエネルギーゲインを特徴づけると仮定します。オリゴチミジル酸塩のKM値と、ヒト胎盤からのDNAポリメラーゼアルファによって触媒されたDNA重合の反応と大腸菌DNAポリメラーゼIの断片Iの反応のテンプレートとしての部分的または完全にエチル化された類似体の比較は、両方の酵素によるテンプレート認識の同様のメカニズムを示唆しています。

The affinity of different ligands (phosphate, nucleoside monophosphates, oligonucleotides) to the template binding site of DNA polymerase alpha from human placenta was estimated. To this goal, dependences of rate of the enzyme inactivation by the affinity reagent d(pT)2pC[Pt2+(NH3)2OH](pT)7 on the concentration of these ligands as competitive inhibitors were determined. Minimal ligands capable to bind with the template site of DNA polymerase alpha were shown to be triethylphosphate (Kd 600 microM) and phosphate (Kd 53 microM). Ligand affinity increases by the factor 1.71 per added monomer unit from phosphate to d(pT) and then for oligothymidylates d(Tp)nT (n 1 to 14). The partial ethylation of phosphodiester groups does not change the efficiency of the oligothymidylate binding with the enzyme. However, the complete ethylation of these groups lowers affinity of the oligothymidylates to the enzyme by 7-9 times. The decrease is comparable with the change of Pt2+-decathymidylate affinity to the enzyme caused by Mn2+-ions. The data obtained led to suggestion that an electrostatic contact (most likely, Me2+-dependent) of phosphodiester group with the enzyme takes place. The type of contact is confirmed by Gibbs' energy change 1.1-1.4 kcal/mole. Formation of a hydrogen bond with the oxygen atom of P = O group of the same phosphate is also assumed (delta G =--4.4 . . .--4.5 kcal/mole). The other internucleotide phosphates and all bases of oligonucleotides form neither hydrogen bonds nor electrostatic contacts with the template binding site. Gibbs' energy changes by 0.32 kcal/mole when the template is lengthened by one unit. We suppose that this value characterizes the energy gain in the transition of oligonucleotide template from aquous medium to the hydrophobic environement of the enzyme active site. Comparison of Km values of oligothymidylates and their partially or completely ethylated analogues as templates in the reaction of DNA polymerization catalysed by DNA polymerase alpha from human placenta and Klenow's fragment of E. coli DNA polymerase I suggests a similar mechanism of template recognition by both enzymes.