前mRNAスプライシング因子U2AF2は、pre-mRNAスプライス部位信号の中心にあるヌクレオチド変異体の明確な立体構造を認識します

必須の前mRNAスプライシング因子U2AF2（U2AF65とも呼ばれます）は、長さと配列の変動にもかかわらず、新生転写産物のポリピリミジン（PY）トラクトシグナルを識別します。以前の研究では、U2AF2 RNA認識モチーフ（RRM1およびRRM2）がウリジンが豊富なRNAを優先的に結合することが示されています。それにもかかわらず、中央のpy管ヌクレオチドのRRM1/RRM2界面の特異性はまだ調査されていません。この質問に対処しました。Py管の中心位置でシチジン、グアノシン、またはアデノシンに結合したU2AF2の結晶構造を決定し、U2AF2結合ウリジン構造を比較しました。RNA部位の局所的な動きは異なるヌクレオチドに対応しましたが、ポリペプチド骨格は構造間で類似したままでした。したがって、分子動力学シミュレーションにより、中心のU2AF2結合ヌクレオチドの柔軟な立体構造が明らかになりました。構造誘導変異体のRNA結合親和性とスプライシング効率は、U2AF2がPy管の中心位置でヌクレオチド置換に耐えることを示しました。さらに、ヒト赤耳血症細胞における内因性U2AF2のUVクロスリンクと免疫沈降の強化は、ウリジンに富んだヌクレオチド位置での低いシーケンス保存のウリジン感受性結合部位を示しました。全体として、これらの結果は、タンパク質認識のRNA柔軟性の重要性を強調し、スプライス部位のモチーフを以前のスプライシング効率に関連付けるために一歩を踏み出します。

The essential pre-mRNA splicing factor U2AF2 (also called U2AF65) identifies polypyrimidine (Py) tract signals of nascent transcripts, despite length and sequence variations. Previous studies have shown that the U2AF2 RNA recognition motifs (RRM1 and RRM2) preferentially bind uridine-rich RNAs. Nonetheless, the specificity of the RRM1/RRM2 interface for the central Py tract nucleotide has yet to be investigated. We addressed this question by determining crystal structures of U2AF2 bound to a cytidine, guanosine, or adenosine at the central position of the Py tract, and compared U2AF2-bound uridine structures. Local movements of the RNA site accommodated the different nucleotides, whereas the polypeptide backbone remained similar among the structures. Accordingly, molecular dynamics simulations revealed flexible conformations of the central, U2AF2-bound nucleotide. The RNA binding affinities and splicing efficiencies of structure-guided mutants demonstrated that U2AF2 tolerates nucleotide substitutions at the central position of the Py tract. Moreover, enhanced UV-crosslinking and immunoprecipitation of endogenous U2AF2 in human erythroleukemia cells showed uridine-sensitive binding sites, with lower sequence conservation at the central nucleotide positions of otherwise uridine-rich, U2AF2-bound splice sites. Altogether, these results highlight the importance of RNA flexibility for protein recognition and take a step towards relating splice site motifs to pre-mRNA splicing efficiencies.