ギブソンアセンブリを使用した合理化された遺伝子クローニングを使用したin situプローブおよび阻害性RNA合成

in situハイブリダイゼーションと遺伝子ノックダウンのための一本鎖リボプローブまたは二本鎖RNAの合成は、多くの場合、時間のかかるプラスミド制限ダイジェストと非効率的なゲル精製を必要とするベクターを使用します。ここでは、同時プラスミド制限消化のためのより高速なプロトコルと、それぞれIN STIUおよびRNA干渉実験のためのリボプローブと二本鎖RNAの両方の合成のためのベクターのギブソンアセンブリを提示します。Planaria in situおよびRNAIアッセイを使用したプロトコルを説明しますが、それはあらゆる生物に適用できます。

The synthesis of single-stranded riboprobes or double-stranded RNAs for in situ hybridization and gene knockdowns often use vectors that require time-consuming plasmid restriction digests and inefficient gel purifications. Here, we present a faster protocol for the simultaneous plasmid restriction digestion and Gibson assembly of vectors for the synthesis of both riboprobes and double-stranded RNAs for in situ and RNA interference experiments, respectively. We illustrate the protocol with planaria in situ and RNAi assays, but it is applicable to any organism.