Mycobacterium smegmatis株は、高レベルのスーパーオキシド、H2O2、ヒドロキシルラジカル、およびFe（II）を含むモキシフロキサシン生存集団からモキシフロキサシンに遺伝的に耐性が発生します。

背景：抗生物質暴露細菌には、多くの場合、反応性酸素種（ROS）、ヒドロキシルラジカルが含まれており、ゲノム全体の変異を与え、抗生物質耐性株のde novo形成を引き起こします。ヒドロキシルラジカルは、Fe（II）とROS、H2O2とのフェントン反応によって生成されます。これは、ROSのスーパーオキシドの反対によって形成されます。したがって、抗生物質に対して遺伝的に耐性のある細菌株の出現には、スーパーオキシド、H2O2、ヒドロキシルラジカル、およびFe（II）のレベルの増加を抗生物質暴露細菌に存在する必要があります。ここでは、長期にわたってモキシフロキサシンのMBCにさらされたM. smegmatisのin vitro培養に、スーパーオキシド、H2O2、ヒドロキシルラジカル、およびFe（II）の有意なレベルが含まれているかどうかを調べることにより、この前提を検証しました。 方法：M。smegmatisの生物学的三重培養物を84時間モキシフロキサシンのMBCにさらした。培養物のコロニー形成ユニット（CFU）は、定期的な間隔6時間で84時間全体で、モキシフロキサシンを含まないモキシフロキシンフリーおよびモキシフロキサシン含有プレートで決定されました。培養物は、Superoxide、H2O2、ヒドロキシルラジカル、およびROSおよびおよびFe（II）の存在について、殺害相（KP）、抗生物質を生む相（ASP）、および再成長相（RGP）の特定の時点で分析しました。Fe（II） - 検出蛍光プローブ。実験培養物は、ROSおよびFe（II）クエンチャーの存在下で成長し、ROSおよびFe（II）固有のプローブに対応する蛍光のレベルを決定しました。これは、ROSとFe（II）の検出の特異性を確立するために実行されました。モキシフロキサシンに暴露​​されたが84時間培養された生物学的な三重培養は、ROSおよびFe（II）レベルの測定のコントロールとして使用されました。培養物のCFUは、6時間の定期的な間隔で84時間全体で、モキシフロキサシンフリーおよびモキシフロキサシン含有プレートで決定されました。ROSおよびFe（II）固有のプローブの蛍光レベルの検出と定量のために、フローサイトメトリー分析を実行しました。実験培養は、ROSおよびFe（II）特異的プローブに対応する蛍光のレベルを測定するために、それぞれROSおよびFe（II）クエンチャーとしてチオウリアとビピリジルの存在下で栽培されました。ペアのt検定を使用して、統計的有意性を計算しました（n = 3）。 結果：モキシフロキサシンに曝露した培養物は、モキシフロキサシンに露出されている培養物ではなく、KP、ASP、およびRGPを使用して三症反応を示しました。後期KPおよびASPの細胞には、スーパーオキシド、H2O2、ヒドロキシルラジカル、およびFe（II）の大幅な上昇レベルが含まれていました。したがって、モキシフロキサシン媒介殺人を生き残ったM. smegmatis細胞の小さな集団（ASP）で高レベルのROSとFe（II）が見つかりました。このモキシフロキサシンを生む集団（ASP）から、モキシフロキサシン耐性の遺伝的再開者は、文化を分裂させ、登録し、高頻度でde novoが出現しました。これらのROS、Fe（II）、および高いモキシフロキサシンリゾスター生成頻度のレベルは、それぞれのROSおよびFe（II）クエンチャーの存在下で成長した培養で消光されました。モキシフロキサシンに暴露​​された培養物は、これらの反応のいずれも示さず、反応全体が抗生物質曝露に特異的であることを示しています。 結論：スーパーオキシド、H2O2、ヒドロキシルラジカル、およびFe（II）の有意な高レベルは、長期にわたってモキシフロキサシンにさらされたM. smegmatis培養で生成されました。それは、高頻度でのモキシフロキサシンへの遺伝的抵抗のde novoの出現を促進しました。

BACKGROUND: The antibiotic-exposed bacteria often contain the reactive oxygen species (ROS), hydroxyl radical, which inflicts genome-wide mutations, causing the de novo formation of antibiotic-resistant strains. Hydroxyl radical is generated by Fenton reaction of Fe (II) with the ROS, H2O2, which, in turn, is formed by the dismutation of the ROS, superoxide. Therefore, for the emergence of bacterial strains genetically resistant to antibiotics, increased levels of superoxide, H2O2, hydroxyl radical, and Fe (II) should be present in the antibiotic-exposed bacteria. Here, we verified this premise by finding out whether the in vitro cultures of M. smegmatis, exposed to MBC of moxifloxacin for a prolonged duration, contain significantly high levels of superoxide, H2O2, hydroxyl radical, and Fe (II). METHODS: Biological triplicate cultures of M. smegmatis, were exposed to MBC of moxifloxacin for 84 h. The colony-forming units (CFUs) of the cultures were determined on moxifloxacin-free and moxifloxacin-containing plates for the entire 84 h at a regular interval of 6 h. The cultures were analyzed at specific time points of killing phase (KP), antibiotic-surviving phase (ASP), and regrowth phase (RGP) for the presence of superoxide, H2O2, hydroxyl radical, and Fe (II) using the ROS- and Fe (II)-detecting fluorescence probes. The experimental cultures were grown in the presence of ROS and Fe (II) quenchers also and determined the levels of fluorescence corresponding to the ROS- and Fe (II)-specific probes. This was performed to establish the specificity of detection of ROS and Fe (II). Biological triplicate cultures, unexposed to moxifloxacin but cultured for 84 h, were used as the control for the measurement of ROS and Fe (II) levels. The CFUs of the cultures were determined on moxifloxacin-free and moxifloxacin-containing plates for the entire 84 h at regular intervals of 6 h. Flow cytometry analyses were performed for the detection and quantitation of the levels of fluorescence of the ROS-and Fe (II)-specific probes. The experimental cultures were grown in the presence of thiourea and bipyridyl as the ROS and Fe (II) quenchers, respectively, for the determination of the levels of fluorescence corresponding to the ROS- and Fe (II)-specific probes. Paired t-test was used to calculate statistical significance (n = 3). RESULTS: The moxifloxacin-exposed cultures, but not the cultures unexposed to moxifloxacin, showed a triphasic response with a KP, ASP, and RGP. The cells in the late KP and ASP contained significantly elevated levels of superoxide, H2O2, hydroxyl radical, and Fe (II). Thus, high levels of the ROS and Fe (II) were found in the small population (in the ASP) of M. smegmatis cells that survived the moxifloxacin-mediated killing. From this moxifloxacin-surviving population (in the ASP), moxifloxacin-resistant genetic resisters emerged de novo at high frequency, regrew, divided, and populated the cultures. The levels of these ROS, Fe (II), and the high moxifloxacin resister generation frequency were quenched in the cultures grown in the presence of the respective ROS and Fe (II) quenchers. The cultures unexposed to moxifloxacin did not show any of these responses, indicating that the whole response was specific to antibiotic exposure. CONCLUSIONS: Significantly high levels of superoxide, H2O2, hydroxyl radical, and Fe (II) were generated in the M. smegmatis cultures exposed to moxifloxacin for a prolonged duration. It promoted the de novo emergence of genetic resisters to moxifloxacin at high frequency.