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ヒト細胞における大規模な遺伝的ペイロードの標的染色体挿入は、合成生物学と遺伝子療法の取り組みを活用し、拡大します。しかし、特に移動しにくい幹細胞および前駆細胞では、大規模な遺伝子ノックインを得ることは特に困難なままです。ここでは、完全にウイルスの遺伝子誘発性アデノベクタ粒子（ADVP）が、最適化された高特性CRISPR-CAS9ヌクレアーゼおよびドナーDNA構築物の原因として調査されます。筋肉前駆細胞では、HMEJを受けやすいドナーは、HRドナーよりもCRISPR-CAS9依存性のゲノム編集頻度が高く、6％から34％の値が得られました。対照的に、誘導された多能性幹細胞（IPSC）におけるHRおよびHMEJ基質のADVPの形質導入は、同様のCRISPR-CAS9依存性ゲノム編集レベルをもたらしました。特に、通常のIPSCと比較すると、p53ノックダウンIPSCで、CRISPR-CAS9依存性ゲノム編集頻度は、HMEJドナーコンストラクトを導入すると、特に6.7倍まで増加しました。最後に、分子濃度による単一のDNA分子分析により、ADVPベースのゲノム編集は、完全長のジストロフィン発現ユニットの部位特異的挿入を通じてDMDを引き起こす変異の長期的な補完を達成することが確認されました。結論として、ADVPはヒト細胞に大きなゲノム編集をインストールするための堅牢で柔軟なプラットフォームであり、p53阻害はiPSCでHMEJベースのゲノム編集を促進します。
ヒト細胞における大規模な遺伝的ペイロードの標的染色体挿入は、合成生物学と遺伝子療法の取り組みを活用し、拡大します。しかし、特に移動しにくい幹細胞および前駆細胞では、大規模な遺伝子ノックインを得ることは特に困難なままです。ここでは、完全にウイルスの遺伝子誘発性アデノベクタ粒子（ADVP）が、最適化された高特性CRISPR-CAS9ヌクレアーゼおよびドナーDNA構築物の原因として調査されます。筋肉前駆細胞では、HMEJを受けやすいドナーは、HRドナーよりもCRISPR-CAS9依存性のゲノム編集頻度が高く、6％から34％の値が得られました。対照的に、誘導された多能性幹細胞（IPSC）におけるHRおよびHMEJ基質のADVPの形質導入は、同様のCRISPR-CAS9依存性ゲノム編集レベルをもたらしました。特に、通常のIPSCと比較すると、p53ノックダウンIPSCで、CRISPR-CAS9依存性ゲノム編集頻度は、HMEJドナーコンストラクトを導入すると、特に6.7倍まで増加しました。最後に、分子濃度による単一のDNA分子分析により、ADVPベースのゲノム編集は、完全長のジストロフィン発現ユニットの部位特異的挿入を通じてDMDを引き起こす変異の長期的な補完を達成することが確認されました。結論として、ADVPはヒト細胞に大きなゲノム編集をインストールするための堅牢で柔軟なプラットフォームであり、p53阻害はiPSCでHMEJベースのゲノム編集を促進します。
Targeted chromosomal insertion of large genetic payloads in human cells leverages and broadens synthetic biology and genetic therapy efforts. Yet, obtaining large-scale gene knock-ins remains particularly challenging especially in hard-to-transfect stem and progenitor cells. Here, fully viral gene-deleted adenovector particles (AdVPs) are investigated as sources of optimized high-specificity CRISPR-Cas9 nucleases and donor DNA constructs tailored for targeted insertion of full-length dystrophin expression units (up to 14.8-kb) through homologous recombination (HR) or homology-mediated end joining (HMEJ). In muscle progenitor cells, donors prone to HMEJ yielded higher CRISPR-Cas9-dependent genome editing frequencies than HR donors, with values ranging between 6% and 34%. In contrast, AdVP transduction of HR and HMEJ substrates in induced pluripotent stem cells (iPSCs) resulted in similar CRISPR-Cas9-dependent genome editing levels. Notably, when compared to regular iPSCs, in p53 knockdown iPSCs, CRISPR-Cas9-dependent genome editing frequencies increased up to 6.7-fold specifically when transducing HMEJ donor constructs. Finally, single DNA molecule analysis by molecular combing confirmed that AdVP-based genome editing achieves long-term complementation of DMD-causing mutations through the site-specific insertion of full-length dystrophin expression units. In conclusion, AdVPs are a robust and flexible platform for installing large genomic edits in human cells and p53 inhibition fosters HMEJ-based genome editing in iPSCs.
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