ピルビン酸キナーゼIの酵素活性とビブリオアルン溶解性の病原性に対するリジン脱アセチル化修飾の効果を特徴付ける

ピルビン酸キナーゼI（PYKF）は解糖の重要な酵素の1つであり、細菌の代謝において重要な役割を果たします。Vibrio alginolyticus pykfのいくつかのアセチル化部位が以前の研究で報告され、次に11の部位がこの研究で最初に検証されましたが、Pykfアセチル化の特定の役割は不明のままです。オーバーラップ-PCRと相同組換えは、V。alginolyticuspykf遺伝子を削除するために暗示され、Pykfの脱アセチル化調節にさらなる研究に焦点を当てるために、部位指向の突然変異誘発の相補的株を構築しました。結果は、PykfのK52、K68、およびK317の脱アセチル化状態でピルビン酸キナーゼ活性が鋭く抑制され、細胞外プロテアーゼ活性がK52およびK68の脱アセチル化状態で有意に減少したが、K317と誘導されなかったことを示した。さらに、V。alginolyticusの成長率は、これら3つの脱アセチル化部位で影響を受けませんでした。Δpykf変異体は、ゼブラフィッシュに対する病原性の6倍の減少を示しました。K52RおよびK68Rの部位指向変異も毒性の低下を示したが、K317Rの変異はそうではなかった。in vitro実験では、Pykfがリン酸アセチル（ACP）によってアセチル化され、ACPによるインキュベーション時間の増加とともに、Pykfのアセチル化レベルが増加し、PYKFの酵素活性はそれに応じて減少しました。その上、PykfはCobb Deacetylaseによって脱アセチル化され、その結果、脱アセチル化は有意にダウンレギュレートされ、Pykfのピルビン酸キナーゼ活性は増加しました。さらに、COBB遺伝子の欠失は、ピルビン酸キナーゼ活性に有意な差はありませんでした。これらの結果は、COBBがPykfのアセチル化レベルとピルビン酸キナーゼ活性を調節できることを確認しています。要約すると、この研究の結果は、PYKFの脱アセチル化修飾をさらに理解するための理論的根拠を提供します。それは、バリオンの予防と治療のための新しいアイデアを提供します。

Pyruvate kinase I (PykF) is one of the key enzymes of glycolysis and plays a crucial role in bacterial metabolism. Several acetylation sites of Vibrio alginolyticus PykF were reported in previous studies and then 11 sites were first verified in this study, however, the specific roles of PykF acetylation remains unclear. Overlap-PCR and homologous recombination were implied to delete V. alginolyticus pykF gene and constructed complementary strains of site-directed mutagenesis for the further research focus on the deacetylation regulation on PykF. The results showed that the pyruvate kinase activity was sharply suppressed in the deacetylation status of K52, K68, and K317 of PykF, as well as the extracellular protease activity was significantly decreased in the deacetylation status of K52 and K68, but not induced with K317. Moreover, the growth rates of V. alginolyticus were not influenced with these three deacetylation sites. The ΔpykF mutant exhibited a 6-fold reduction in virulence to zebrafish. Site-directed mutations of K52R and K68R also showed reduced virulence while mutations of K317R didn't. The in vitro experiments showed that PykF was acetylated by acetyl phosphate (AcP), with the increase of incubation time by AcP, the acetylation level of PykF increased while the enzyme activity of PykF decreased correspondingly. Besides, PykF was deacetylated by CobB deacetylase and in result that the deacetylation was significantly down-regulated while the pyruvate kinase activity of PykF increased. Moreover, deletion of cobB gene had no significant difference in pyruvate kinase activity. These results confirm that CobB can regulate the acetylation level and pyruvate kinase activity of PykF. In summary, the results of this study provide a theoretical basis for further understanding of the deacetylation modification of PykF. It provides a new idea for the prevention and cure of vibriosis.