Mneongreenでタンパク質をタグ付けするためのHELA細胞のCRISPR/CAS9遺伝子編集

シグナル伝達プロセスに関与するタンパク質の細胞内局在ダイナミクスは、シグナル伝達の結果を決定する上で重要です。ただし、生細胞における内因性シグナル伝達タンパク質の局在に関する情報は非常に限られています。たとえば、表皮成長因子（EGF）受容体（EGFR）からRAS-RAFおよびERK1/2/MAPKへのシグナル伝達経路の根底にある生化学的メカニズムはよく理解されていますが、細胞内のこの経路の動作ドメインはあまり特徴づけられません。蛍光タンパク質を使用したシグナル伝達経路の内因性成分のタグ付けにより、内因性調節メカニズムによって制御される天然の発現レベルで細胞内ダイナミクスのより正確な特性評価を可能にし、したがって、過剰発現と誤った誤りの可能な破壊効果を回避します。この研究では、GRB2、KRAS、NRASなどのEGFR-Ras-Mapk経路の成分をラベル付けする方法論的アプローチを説明し、CRISPR/Cas9遺伝子編集を使用した蛍光タンパク質Mneongreen（MNG）、ならびに生成の生成を使用して説明します。編集されたターゲットタンパク質のホモ接合シングルセルクローン。

Subcellular localization dynamics of proteins involved in signal transduction processes is crucial in determining the signaling outcome. However, there is very limited information about the localization of endogenous signaling proteins in living cells. For example, biochemical mechanisms underlying the signaling pathway from epidermal growth factor (EGF) receptor (EGFR) to RAS-RAF and ERK1/2/MAPK are well understood, whereas the operational domains of this pathway in the cell remain poorly characterized. Tagging of endogenous components of signaling pathways with fluorescent proteins allows more accurate characterization of their intracellular dynamics at their native expression levels controlled by endogenous regulatory mechanisms, thus avoiding possible tainting effects of overexpression and mistargeting. In this study, we describe methodological approaches to label components of the EGFR-RAS-MAPK pathway, such as Grb2, KRAS, and NRAS, with the fluorescent protein mNeonGreen (mNG) using CRISPR/Cas9 gene-editing, as well as generation of homozygous single-cell clones of the edited target protein.