大腸菌の速度論的特性と計算モデリングヘプトシルトランスフェラーゼII：GT-Bグリコシルトランスフェラーゼの触媒におけるタンパク質ダイナミクスの役割の調査

グリコシルトランスフェラーゼ（GT）酵素は、糖分子と多様な基質との間にグリコシド結合の形成を促進します。ヘプトシルトランスフェラーゼII（HEPII）は、7炭素糖（L-グリセロ-D-マンノヘプトース、HEP）を脂質分類グリコポリマー（ヘプトシル化KDO2-リピッドA）に移転するリポ多糖（LPS）生合成経路に関与するGTです。hep-kdo2-lipid a、またはhla）。LPSは、グラム陰性の細菌性敗血症、バイオフィルム形成、宿主コロニー形成において重要な役割を果たしているため、LPS生合成酵素は新規の抗菌性治療の標的です。3つのヘプトシルトランスフェラーゼが内部コアLPS生合成に関与しており、大腸菌Hepiiはin vivoで定量的に特徴付けられる最後のものです。HEPIIは、高度な構造相同性を維持しながら、ヘプトシルトランスフェラーゼI（HEPI）と控えめな配列の類似性を共有しています。ここでは、HEPIIの最初の速度論的および生物物理学的特性を報告し、砂糖ドナーの乱交や砂糖受容体誘発二次構造変化を含むHEPIと共有されるHEPIIの特性を実証します。HEPIIは、HEPIと比較して、両方の基質に対して触媒効率が向上し、結合親和性が大幅に増加しています。分子動力学シミュレーションによって洗練されたHEPII成分複合体の構造モデルは、潜在的に重要な基質タンパク質接触を調べるために開発されました。HEPIIのTRP蛍光のリガンド結合誘導変化により、基質解離定数の測定が可能になりました。組み合わされて、これらの取り組みは、酵素のヘプトシルトランスフェラーゼファミリーの理解を有意に強化し、この酵素ファミリーのための新規、強力、および特定の阻害剤を設計する将来の努力を支援します。

Glycosyltransferase (GT) enzymes promote the formation of glycosidic bonds between a sugar molecule and a diversity of substrates. Heptosyltransferase II (HepII) is a GT involved in the lipopolysaccharide (LPS) biosynthetic pathway that transfers the seven-carbon sugar (l-glycero-d-manno-heptose, Hep) onto a lipid-anchored glycopolymer (heptosylated Kdo2-Lipid A, Hep-Kdo2-Lipid A, or HLA). LPS plays a key role in Gram-negative bacterial sepsis, biofilm formation, and host colonization, and as such, LPS biosynthetic enzymes are targets for novel antimicrobial therapeutics. Three heptosyltransferases are involved in the inner-core LPS biosynthesis, with Escherichia coli HepII being the last to be quantitatively characterized in vivo. HepII shares modest sequence similarity with heptosyltransferase I (HepI) while maintaining a high degree of structural homology. Here, we report the first kinetic and biophysical characterization of HepII and demonstrate the properties of HepII that are shared with HepI, including sugar donor promiscuity and sugar acceptor-induced secondary structural changes, which results in significant thermal stabilization. HepII also has an increased catalytic efficiency and a significantly tighter binding affinity for both of its substrates compared to HepI. A structural model of the HepII ternary complex, refined by molecular dynamics simulations, was developed to probe the potentially important substrate-protein contacts. Ligand binding-induced changes in Trp fluorescence in HepII enabled the determination of substrate dissociation constants. Combined, these efforts meaningfully enhance our understanding of the heptosyltransferase family of enzymes and will aid in future efforts to design novel, potent, and specific inhibitors for this family of enzymes.