翻訳とその制御を研究するための40代および80年代のリボソーム亜集団（SEL-TCP-SEQ）の選択的フットプリント

mRNA翻訳の複数の側面は規制の対象となります。ここでは、酵母および哺乳類細胞のin vivo内の内因性mRNA上の40Sおよび80年代のリボソーム複合体の位置と組成を決定するリボソームフットプリントプロトコルを提示します。元々酵母で開発された翻訳複合プロファイリング（TCP-SEQ）プロトコルの拡張を提示します。これは、目的のタンパク質を含む40年代および80年代のリボソーム複合体の両方の位置をアッセイするための免疫沈降ステップを含めて含めます。これにより、MRNAに沿って、関心のあるリボソームに縛られたタンパク質がリボソームに加わり、再び出発する場所に関する情報が得られ、それによって翻訳の連続的なステップとその中のさまざまな翻訳因子の役割を監視します。生細胞を迅速に固定すると、ネイティブ位置でmRNAに結合したすべての翻訳複合体の完全性が保証されます。主に固定条件とライブラリの準備が異なる2つの手順について説明します。研究の質問に応じて、どちらの手順も利点を提供します。SEL-TCP-seq実験の実行には5〜10営業日かかり、2日以内に初期データ分析を完了できます。

Multiple aspects of mRNA translation are subject to regulation. Here we present a ribosome footprinting protocol to determine the location and composition of 40S and 80S ribosome complexes on endogenous mRNAs transcriptome-wide in vivo in yeast and mammalian cells. We present an extension of the translation complex profiling (TCP-seq) protocol, originally developed in yeast, by including an immunoprecipitation step to assay the location of both 40S and 80S ribosome complexes containing proteins of interest. This yields information on where along mRNAs the ribosome-bound protein of interest joins the ribosome to act, and where it leaves again, thereby monitoring the sequential steps of translation and the roles of various translation factors therein. Rapid fixation of live cells ensures the integrity of all translation complexes bound to mRNA at native positions. Two procedures are described, differing mainly in the fixation conditions and the library preparation. Depending on the research question, either procedure offers advantages. Execution of a Sel-TCP-seq experiment takes 5-10 working days, and initial data analysis can be completed within 2 days.