シトクロムP450で導入されたヒトTK6細胞を使用したニトロソアミン不純物の遺伝毒性評価

多くのニトロソアミンは、変異体および強力なげっ歯類発がん物質として認識されています。過去数年にわたって、麻薬のリコールにつながるさまざまな薬物でニトロソアミンの不純物が検出されてきました。ニトロソアミンは、潜在的な人間の健康リスクのために「懸念のコホート」に含まれていますが、この懸念のほとんどはげっ歯類がんと細菌の変異原性データに基づいており、ヒトベースのシステムにおける遺伝毒性に関するデータはほとんどありません。この研究では、ヒトシトクロムP450（CYP）2A6を形質導入したヒトリンパ芽球TK6細胞を使用して、薬物産物の不純物として同定されている6つのニトロソアミンの遺伝毒性を評価しました。N-ニトロソ-N-メチル-4-アミノブタン酸（NMBA）、N-ニトロソメチルフェニルアミン（NMPA）、N-ニトロソジイソプロピルアミン（NDIPA）、およびN-ニトロソジビルアミン（NDBA）。フローサイトメトリーベースのアッセイを使用して、NDEA、NEIPA、NMBA、およびNMPAによる24時間処理により、CYP2A6発現TK6細胞のヒストンH2A.x（γH2A.x）のリン酸化が濃度依存性の増加をもたらすことがわかりました。CYP2A6によるこれら4つのニトロソアミンの代謝も、G2/M相の細胞周期停止と同様に、小核頻度の有意な増加を引き起こしました。さらに、NDEA、NEIPA、およびNMPAに曝露したCYP2A6発現TK6細胞で核p53活性化が見つかりました。全体として、私たちのテストシステムにおける6つのニトロソアミン不純物の遺伝毒性効力は、NMPA>ndea≈Neipa> nmba>ndba≈ndipaでした。この研究は、ヒト細胞におけるニトロソアミンの遺伝毒性の可能性に関する新しい情報を提供し、従来のアッセイから生成されたテスト結果を補完し、ヒトのニトロソアミン遺伝毒性の関連性の問題に部分的に対処します。ここで報告されている代謝的に有能なヒト細胞システムは、薬物に見られるニトロソアミン不純物のリスク評価の有用なモデルである可能性があります。

Many nitrosamines are recognized as mutagens and potent rodent carcinogens. Over the past few years, nitrosamine impurities have been detected in various drugs leading to drug recalls. Although nitrosamines are included in a 'cohort of concern' because of their potential human health risks, most of this concern is based on rodent cancer and bacterial mutagenicity data, and there are little data on their genotoxicity in human-based systems. In this study, we employed human lymphoblastoid TK6 cells transduced with human cytochrome P450 (CYP) 2A6 to evaluate the genotoxicity of six nitrosamines that have been identified as impurities in drug products: N-nitrosodiethylamine (NDEA), N-nitrosoethylisopropylamine (NEIPA), N-nitroso-N-methyl-4-aminobutanoic acid (NMBA), N-nitrosomethylphenylamine (NMPA), N-nitrosodiisopropylamine (NDIPA), and N-nitrosodibutylamine (NDBA). Using flow cytometry-based assays, we found that 24-h treatment with NDEA, NEIPA, NMBA, and NMPA caused concentration-dependent increases in the phosphorylation of histone H2A.X (γH2A.X) in CYP2A6-expressing TK6 cells. Metabolism of these four nitrosamines by CYP2A6 also caused significant increases in micronucleus frequency as well as G2/M phase cell-cycle arrest. In addition, nuclear P53 activation was found in CYP2A6-expressing TK6 cells exposed to NDEA, NEIPA, and NMPA. Overall, the genotoxic potency of the six nitrosamine impurities in our test system was NMPA > NDEA ≈ NEIPA > NMBA > NDBA ≈ NDIPA. This study provides new information on the genotoxic potential of nitrosamines in human cells, complementing test results generated from traditional assays and partially addressing the issue of the relevance of nitrosamine genotoxicity for humans. The metabolically competent human cell system reported here may be a useful model for risk assessment of nitrosamine impurities found in drugs.