立体構造の波のキャッチ：微小管の先端の分解から外側にカールするときに、プロトフィラメントの作動ストロークを測定する

光学トラップにより、キネシンやダイニンモーターなどのメカノ酵素が微小管に沿って歩く方法、ミオシンがF-アクチンに沿ってどのように移動するか、および核酸酵素がDNAまたはRNAに沿ってどのように移動するかについての基礎的研究が可能になりました。多くの場合、糸状基質は単にメカニオ酵素の受動的なトラックとして機能しますが、微小管とF-アクチンはそれ自体が動的なタンパク質ポリマーであり、従来のモーターとは独立して動きと力を生成し、力を生成できます。微小管駆動力は、有糸分裂中に特に重要であり、中期プレートで重複した染色体を整列させてから、後期中にそれらを引き離します。これらの重要な動きは、染色体を動的な微小管フィラメントの先端に結合するキネトコアと呼ばれる特殊なタンパク質アセンブリに依存し、それにより、フィラメントの短縮が引っ張り力を生成することを可能にします。多くのキネトコアサブコンプレックスの構造と機能を理解するために大きな進歩がなされてきましたが、微小管の先端への結合の生物物理学的根拠は不明のままです。先端分解中に、微小管格子のまっすぐなプロトフィラメントが外側にカールすると、ひずみエネルギーが放出され、微小管を伝播する立体配座波が生じます。人気のある視点は、キネトコアの外向きのフック要素をカールし、それらを引っ張り、キネトコアに曲率ひずみエネルギーの一部を移したことです。このアイデアのテストに向けた最初のステップとして、最近、カールプロトフィラメントによって生成された作業ストロークを直接測定するためのレーザートラップアッセイを開発しました。私たちの「波」アッセイは、以前の先駆的な研究に基づいており、力の機能とそれらの立体構造ひずみエネルギーの定量化としてのカール駆動運動の測定を可能にする改善があります。この章では、アッセイの詳細なプロトコルを提供し、機器のセットアップとデータ分析方法を簡単に説明します。

Optical traps have enabled foundational studies of how mechanoenzymes such as kinesins and dynein motors walk along microtubules, how myosins move along F-actin, and how nucleic acid enzymes move along DNA or RNA. Often the filamentous substrates serve merely as passive tracks for mechanoenzymes but microtubules and F-actin are themselves dynamic protein polymers, capable of generating movement and force independently of conventional motors. Microtubule-driven forces are particularly important during mitosis, when they align duplicated chromosomes at the metaphase plate and then pull them apart during anaphase. These vital movements depend on specialized protein assemblies called kinetochores that couple the chromosomes to the tips of dynamic microtubule filaments, thereby allowing filament shortening to produce pulling forces. Although great strides have been made toward understanding the structures and functions of many kinetochore subcomplexes, the biophysical basis for their coupling to microtubule tips remains unclear. During tip disassembly, strain energy is released when straight protofilaments in the microtubule lattice curl outward, creating a conformational wave that propagates down the microtubule. A popular viewpoint is that the protofilaments as they curl outward hook elements of the kinetochore and tug on them, transferring some of their curvature strain energy to the kinetochore. As a first step toward testing this idea, we recently developed a laser trap assay to directly measure the working strokes generated by curling protofilaments. Our "wave" assay is based on an earlier pioneering study, with improvements that allow measurement of curl-driven movements as functions of force and quantification of their conformational strain energy. In this chapter, we provide a detailed protocol for our assay and describe briefly our instrument setup and data analysis methods.