メッセンジャーRNAのin vitro転写中のカオトロピック剤による二本鎖RNA還元

ビトロ内で転写されたメッセンジャーRNA（mRNA）は、最近、ワクチンと治療薬の発生において重要性の増加を示しています。免疫原性二本鎖RNA（DSRNA）は、in vitro転写中に形成された望ましくない副産物（IVT）であり、同様のサイズと固有の特性のために、mRNAからのDSRNA副産物を減らすことは困難です。DSRNAの除去は、特に長いmRNAの場合、製造コストを増加させ、収量を削減し、しばしば完全性を低下させる、逆相高圧液体クロマトグラフィーなどのIVT後クロマトグラフィーの精製に大きく依存しています。したがって、IVT中のdsRNAのレベルを下げて制御することが理想的です。ここでは、IVT中のdsRNA副産物の形成を減らすためのシンプルでスケーラブルで制御可能な方法を提示します。最適化された濃度で選択されたカオトロピック剤がIVT中に含まれており、軽度の変性環境を作成して、RNAポリメラーゼによるRNAテンプレートDSRNA形成を促進すると考えられている望ましくない分子間または分子内塩基対を防ぎます。通常のIVTと比較して、私たちの改善された方法は、dsRNAが大幅に少なく、免疫刺激がはるかに低く、より効率的なタンパク質発現を伴うmRNAを生成します。したがって、この方法は潜在的にdsRNA除去精製ステップを排除し、マグネシウム濃度の低下、温度の上昇、またはカスタム試薬を必要としないため、mRNA製造のための簡単で高効率の高効率のスケールアップアプローチを可能にします。

In-vitro-transcribed messenger RNA (mRNA) has recently shown increasing significance in the development of vaccines and therapeutics. Immunogenic double-stranded RNA (dsRNA) is an undesired byproduct formed during in vitro transcription (IVT), and it is challenging to reduce dsRNA byproduct from mRNA due to their similar sizes and intrinsic characteristics. Removal of dsRNA relies heavily on post-IVT chromatography purifications, such as reverse-phase high-pressure liquid chromatography, which increase manufacturing costs, reduce yield, and often decrease integrity, especially for long mRNA. Thus, it would be ideal to reduce and control the level of dsRNA during IVT. We herein present a simple, scalable, and controllable method to reduce the formation of dsRNA byproducts during IVT. Selected chaotropic agents at optimized concentrations are included during IVT to create a mild denaturing environment to prevent the undesired intermolecular or intramolecular base-pairing that is thought to promote RNA-templated dsRNA formation by RNA polymerase. Compared with regular IVT, our improved method produces mRNA with significantly less dsRNA, much lower immuno-stimulation, and more efficient protein expression. Therefore, this method potentially eliminates dsRNA removal purification steps and does not require reduced magnesium concentration, elevated temperature, or custom reagents, enabling a straightforward, high-yield, and cost-effective scale-up approach for mRNA manufacturing.