CRISPR/CAS9リボ核タンパク質（RNP）複合体は、急性骨髄細胞のゲノム編集においてトランスフェクト細胞のより高い生存率を可能にします

背景：クラスター化された定期的に散在する短いパリンドロミックリピート（CRISPR）/CRISPR関連タンパク質9（CAS9）は、さまざまな細胞タイプで遺伝子発現を修正するためのますます重要なツールになりました。レンチウイルスの形質導入とエレクトロポレーションは、CRISPR/CAS9を細胞に供給するために使用される2つの主要なアプローチです。ただし、原発性造血細胞におけるCRISPR/CAS9の適用は、ウイルスベースの送達またはCRISPR/CAS9リボン核タンパク質（RNP）のエレクトロポレーションに関するトランスフェクトおよび編集された細胞の困難な選択と濃縮の観点からの低いトランスデューション効率のいずれかのために制限されています。。 方法：この研究では、in vitro転写を使用してガイドRNA（GRNA）を合成し、プラスミドPL-Crispr.EFS.GFPをDNAテンプレートとして使用しました。次に、in vitro転写されたGRNAを、Cas9タンパク質とインキュベートする前に、T4リガーゼを介してPCP-CY5で標識されました。さらに、CRISPR/CAS9 RNPは、臍帯血から分離された一次CD34+細胞に電気物質化され、細胞生存率とトランスフェクション効率が計算され、レンチウイルス形質導入のそれと比較されました。 結果：ここで、CRISPR/Cas9 RNPのエレクトロポレーションにより、CRISPR/CAS9オールインワンプラスミドのエレクトロポレーションと比較して細胞生存率が高くなり、CRISPR/Cas9テクノロジーを介した血液学のさらなる研究の重要な発見を提供します。さらに、in vitroで転写されたGRNAをフルオロフォアで標識する方法を確立し、ソートされた蛍光細胞は、非硬化トランスフェクト細胞よりも高いノックアウト効率を示しました。 結論：CRISPR/Cas9 RNPという標識標識蛍光のエレクトロポレーションは、遺伝子編集の視点アプローチです。私たちの研究は、造血細胞におけるゲノム編集のための効率的かつ時間節約的なアプローチを提供します。

BACKGROUND: Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) has become an increasingly vital tool for modifying gene expression in a variety of cell types. Lentiviral transduction and electroporation are the two main approaches used to deliver CRISPR/Cas9 into cells. However, the application of CRISPR/Cas9 in primary hematopoietic cells has been limited due to either low transduction efficiency in terms of viral-based delivery or difficult selection and enrichment of transfected and edited cells with respect to electroporation of CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein (RNP). METHODS: In this study in vitro transcription was used to synthesize the guide RNA (gRNA), and plasmid pL-CRISPR.EFS.GFP was used as its DNA template. Then the in vitro transcribed gRNA was labeled with pCp-Cy5 via T4 ligase before incubating with Cas9 protein. Furthermore, CRISPR/Cas9 RNP was electroporated into primary CD34+ cells isolated from cord blood, and cell survival rate and transfection efficiency were calculated and compared to that of lentiviral transduction. RESULTS: Here, we show that electroporation of CRISPR/Cas9 RNP resulted in higher cell viability compared to electroporation of CRISPR/Cas9 all-in-one plasmid, providing important findings for further studies in hematology via CRISPR/Cas9 technology. Moreover, we established a method for labeling in vitro-transcribed gRNA with fluorophore and the sorted fluorescent cells displayed higher knockout efficiency than nonsorted transfected cells. CONCLUSIONS: Electroporation of fluorescence labeled CRISPR/Cas9 RNP is a perspective approach of gene editing. Our study provides an efficient and time-saving approach for genome-editing in hematopoietic cells.