BMP立体構造エピトープの構造マッピングと、エピトープ結合部位を特異的に標的とする骨形成ペプチドのバイオエンジニアリング設計

はじめに：ヒト骨形態形成タンパク質（BMPS）は、変換成長因子-βスーパーファミリーのメンバーに関連するサイトカインの大ファミリーを構成し、同族のタイプI（BRI）およびタイプII（BRII）受容体に結合する特異性によって生物学的機能を満たします。それぞれ立体構造の手首と線形ナックルエピトープ。 方法と結果：構造的、エネルギー的、動的レベルで、BMPタンパク質とBRI受容体間の分子間認識と相互作用を体系的に調べました。BRI結合部位は、BMP表面の3つのホットスポット領域で構成されており、BMP-BRI結合イベントに約70％の効力に完全に寄与し、BMP立体構造リストエピトープのコアセクションを表しています。貢献度は順序で増加します：Hotspot 2（〜8％）<Hotspot 3（〜20％）<Hotspot 1（〜40％）。複数のシーケンスアライメントと構造的重ね合わせにより、コンセンサスシーケンスパターンと、ほとんどのBMPメンバーが共有する3つのホットスポットの同様の結合モードが明らかになり、BMPファミリーの手首エピトープの高い保存が示されました。3つのホットスポットは、BMPタンパク質のよく構造化されたU字型のU字型のループと二本鎖の立体構造にネイティブに折りたたまれていますが、タンパク質のコンテキストから分裂して自由状態の骨形成ペプチドを導き出すと、大部分が無秩序になり、したがって、リベンディングを大幅に損なうことができます。BRI受容体への能力。この点で、環化戦略を採用して、ホットスポット1/3由来のペプチドを在来の立体構造に制限しました。これは、ネイティブコンフォメーションに基づいて線形ペプチドのエンドアーム全体にジスルフィド結合を追加することによって行われました。蛍光ベースのアッセイは、環化がBRI受容体への骨形成ペプチドの結合親和性を3〜6倍も効果的に改善できることを実証しました。また、環状ペプチドは、BRIIよりもBRIに対して良好な選択性を示し、BRI受容体の手首エピトープ結合部位を特異的に標的とすることができることを確認します。 結論：合理的に設計された環状ペプチドは、軟骨細胞の老化および骨障害に対する治療的骨形成ペプチドをさらに生体工学するために、in vivoでの生物学的安定性を高めるためにさらに化学的に修飾する必要がある有望なリードエンティティと見なすことができます。

INTRODUCTION: Human bone morphogenetic proteins (BMPs) constitute a large family of cytokines related to members of the transforming growth factor-β superfamily, which fulfill biological functions by specificity binding to their cognate type I (BRI) and type II (BRII) receptors through conformational wrist and linear knuckle epitopes, respectively. METHODS AND RESULTS: We systematically examined the intermolecular recognition and interaction between the BMP proteins and BRI receptor at structural, energetic and dynamic levels. The BRI-binding site consists of three hotspot regions on BMP surface, which totally contribute ~70% potency to the BMP-BRI binding events and represent the core sections of BMP conformational wrist epitope; the contribution increases in the order: hotspot 2 (~ 8%) < hotspot 3 (~ 20%) < hotspot 1 (~ 40%). Multiple sequence alignment and structural superposition revealed a consensus sequence pattern and a similar binding mode of the three hotspots shared by most BMP members, indicating a high conservation of wrist epitope in BMP family. The three hotspots are natively folded into wellstructured U-shaped,, loop and double-stranded conformations in BMP proteins, which, however, would become largely disordered when splitting from the protein context to derive osteogenic peptides in free state, thus largely impairing their rebinding capability to BRI receptor. In this respect, cyclization strategy was employed to constrain hotspot 1/3-derived peptides into a native-like conformation, which was conducted by adding a disulfide bond across the ending arms of linear peptides based on their native conformations. Fluorescence-based assays substantiated that the cyclization can effectively improve the binding affinities of osteogenic peptides to BRI receptor by 3-6-fold. The cyclic peptides also exhibit a good selectivity for BRI over BRII (> 5-fold), confirming that they can specifically target the wrist epitope-binding site of BRI receptor. CONCLUSION: The rationally designed cyclic peptides can be regarded as the promising lead entities that should be further chemically modified to enhance their in vivo biological stability for further bioengineering therapeutic osteogenic peptides against chondrocyte senescence and bone disorder.