CRISPR-CAS9を使用した同時HDRの過剰発現とNHEJ抑制によるポプラの正確な外因性挿入と配列置換

CRISPRを介したゲノム編集は、生物学的特性の遺伝的修飾のための強力なツールとなっています。ただし、相同性指向DNA修復（HDR）に基づいた効率的な部位固有の遺伝子ノックインシステムを開発することは、植物、特にポプラのような木質種において依然として重要な課題です。ここでは、非相対末端結合（NHEJ）組換え皮質XRCC4の同時阻害とHDRエンハンサー因子CTIPとMRE11の過剰発現が遺伝子ノックインのHDR効率を改善できることを示します。このアプローチを使用して、ブレール遺伝子をMKK2 MAPキナーゼ遺伝子の3 '末端に統合して、ブレールMKK2融合タンパク質を生成しました。TaqmanリアルタイムPCRによって評価された完全に編集されたヌクレオチドに基づいて、HDRを介したノックイン効率は、HDRの強化またはNHEJサイレンシングと比較してCTIPとMRE11の過剰発現の組み合わせと組み込まれたXRCC4サイレンシングを使用する場合、最大48％でした。さらに、HDRエンハンサーの過剰発現とNHEJ抑制のこの組み合わせも、ゲノムターゲティング効率を高め、CRISPR誘導挿入と欠失（インデル）を7倍少なくし、ポプラのMKK2ベースの塩ストレス応答に機能的な影響を与えませんでした。したがって、このアプローチは、Poplarや植物や作物だけでなく、CRISPRを介した遺伝子ノックイン効率を改善するための哺乳類でも有用かもしれません。

CRISPR-mediated genome editing has become a powerful tool for the genetic modification of biological traits. However, developing an efficient, site-specific, gene knock-in system based on homology-directed DNA repair (HDR) remains a significant challenge in plants, especially in woody species like poplar. Here, we show that simultaneous inhibition of non-homologous end joining (NHEJ) recombination cofactor XRCC4 and overexpression of HDR enhancer factors CtIP and MRE11 can improve HDR efficiency for gene knock-in. Using this approach, the BleoR gene was integrated onto the 3' end of the MKK2 MAP kinase gene to generate a BleoR-MKK2 fusion protein. Based on fully edited nucleotides evaluated by TaqMan real-time PCR, the HDR-mediated knock-in efficiency was up to 48% when using XRCC4 silencing incorporated with a combination of CtIP and MRE11 overexpression compared with no HDR enhancement or NHEJ silencing. Furthermore, this combination of HDR enhancer overexpression and NHEJ repression also increased genome targeting efficiency and gave 7-fold fewer CRISPR-induced insertions and deletions (InDels), resulting in no functional effects on MKK2-based salt stress responses in poplar. Therefore, this approach may be useful not only in poplar and plants or crops but also in mammals for improving CRISPR-mediated gene knock-in efficiency.