タンパク質溶液の大規模な凍結融解：乳酸デヒドロゲナーゼの安定性に関する凍結濃縮と氷の表面積の相対的な寄与の研究

バルクの生物療法薬は、しばしば塗りつぶしの仕上げと出荷中に安定性を改善するために凍結しますが、最適下凍結融解（F/T）プロセス中に生物活動の損失につながる劣化を受ける可能性があります。いくつかの小規模な研究を除き、タンパク質の不安定性に対するさまざまなF/Tストレスの相対的な寄与は対処されていません。したがって、この研究の目的は、実用的な製造スケールでのタンパク質の不安定化への凍結濃縮、氷の表面積、および処理時間の個々の貢献を決定することでした。ヒスチジンバッファー溶液中の乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）を1L容器で凍結しました。凍結溶液を代表的なサンプルにスライスし、氷特異的表面積（SSA）と溶質の凍結濃縮の範囲について評価されました。私たちの知る限り、ICE SSAは、体積窒素吸着等温線を使用して、大型タンパク質溶液の乾燥サンプルで測定されました。凍結乾燥したケーキのSSA測定により、氷の表面積が凍結速度の増加とともに増加することが示されました。氷のSSAは、容器内のサンプルの位置によっても影響を受けました。容器の活性冷却表面に近いサンプルは、ボトルの中央からの氷層のサンプルと比較して小さな氷の表面積を示しました。凍結濃縮組成は、氷層サンプルのLDH濃度を測定することにより決定されました。タンパク質は、高速凍結後に凍結溶液全体により均等に分布しました。これは、遅い凍結条件と比較してタンパク質の安定性の向上と相関していました。全体として、より優れたタンパク質安定性パラメーターは、より高い氷のSSAおよびより速い凍結速度で達成された凍結濃縮範囲の低いと相関していました。したがって、凍結濃縮微小環境でのタンパク質の延長時間は、バルクヒスチジンバッファーシステムでのLDHの凍結中の重要な不安定化因子です。この研究は、凍結ストレスの相対的な寄与の理解を拡大します。これは、凍結保護メカニズムの知識と相まって、安定した凍結タンパク質溶液を向ける最適化されたプロセスと製剤の開発に不可欠です。

Although bulk biotherapeutics are often frozen during fill finish and shipping to improve their stability, they can undergo degradation leading to losses in biological activity during sub-optimal freeze-thaw (F/T) process. Except for a few small-scale studies, the relative contribution of various F/T stresses to the instability of proteins has not been addressed. Thus, the objective of this study was to determine the individual contributions of freeze-concentration, ice surface area, and processing time to protein destabilization at a practical manufacturing-scale. Lactate dehydrogenase (LDH) in histidine buffer solutions were frozen in 1L containers. The frozen solutions were sliced into representative samples and assessed for the ice specific surface area (SSA) and extent of solutes freeze-concentration. For the first time to our knowledge, ice SSA was measured in dried samples from large-volume protein solutions using volumetric nitrogen adsorption isotherms. SSA measurements of the freeze-dried cakes showed that the ice surface area increased with an increase in the freezing rate. The ice SSA was also impacted by the position of the sample within the container: samples closer to the active cooled surface of the container exhibited smaller ice surface area compared to ice-cored samples from the center of the bottle. The freeze-concentrate composition was determined by measuring LDH concentration in the ice-cored samples. The protein distributed more evenly throughout the frozen solution after fast freezing which also correlated with enhanced protein stability compared to slow freezing conditions. Overall, better protein stability parameters correlated with higher ice SSA and lower freeze-concentration extent which was achieved at a faster freezing rate. Thus, extended residence time of the protein at the freeze-concentrated microenvironment is the critical destabilizing factor during freezing of LDH in bulk histidine buffer system. This study expands the understanding of the relative contributions of freezing stresses which, coupled with the knowledge of cryoprotection mechanisms, is imperative to the development of optimized processes and formulations aiming stable frozen protein solutions.